RNA-seq从入门到自闭（前言+数据获取）

这个周末前，CJ大神终于完成了RNA-seq流程中从原始SRA数据获取到RNA-seq定量的一系列插件。具体文章见链接。
https://www.jianshu.com/p/c8b08314e133

整体上，覆盖了数个功能，四个插件：

1. SRA 数据查询与整理：SRA XML to Table，见推文：挖掘SRA的辅助小工具（NCBI高通量测序数据收录库）https://mp.weixin.qq.com/s/FnuSUqhpyKqm_HYpu6phnw
2. SRA 数据链接获取：SRA XML to Table 和 SRA Number to ENA Info. 前者已经包括了 NCBI 和 DDBJ 数据下载链接，后者主要作为补充，附加 ENA 下载链接（更为稳点）。详细见：公开可获取~没有下载不到的测序原始数据！https://mp.weixin.qq.com/s/CS04e0QRjq0B-NZUfCpUAg
3. Ascp GUI Wrapper：个人实测，每天清晨通过 FTP 链接下载测序原始数据，速度可以达到 10Mb/s。但更多时候数据只有不到 300Kb/s。网络合适的情况下，可以使用 Aspera ，速度可以达到 30Mb/s。于是写了并公开释放了这个插件，详细见：插件 | 人人-点点点-光速下载 NCBI/ENA NGS原始数据 https://mp.weixin.qq.com/s/YYneVPb3V6Dq5WXiq2JYTQ
4. SRAtoFastq，sra 是 NCBI 定义的二代数据存储格式，文件大小比fastq.gz下，考虑网络带宽的情况下，下载 sra 数据更方便。下载后需要进行转换，于是有了插件，详细见：SRAtoFastq | 任何人都能自主分析测序原始数据 https://mp.weixin.qq.com/s/WC6Q1wr2M4CsdVZ2XYFjRA
5. FastQC，无论是NCBI SRA等数据库下载，还是公司返还的测序数据，多少还是要看下测序质量，确保质量OK 或者不要有样品降解，严重污染云云，于是有插件，详细见：插件FastQC | 点点点，人人看看测序数据质量 https://mp.weixin.qq.com/s/Sz9enr_8s9P0goxEObn4TA
6. Trimmomatic，无论转换得到，或者是公司测序后返还的 Fastq.gz 数据往往是原始数据，通过 FastQC 可以判断，随后进行质量控制，如去除接头和低质量碱基，于是有插件，详细见：Trimmomatic | 点点点，测序原始数据质控，技能√get https://mp.weixin.qq.com/s/Gmazcogi2KBNkv7J4hXh9Q
7. Kallisto，RNAseq 数据的基本分析和目的，就是获得基因表达量矩阵。在普通笔记本上，如 4G 内存云云，那么 Kallisto 是最好的选择，于是有插件，详细见：
   Kallisto | 点点点，从 测序数据 到 基因表达量矩阵 人人都可以！ https://mp.weixin.qq.com/s/zhYjsF-LiPzPetbVh7bfcA
8. Trans Value Sum，Kallisto 分析结果是转录本水平的表达量或Counts矩阵，但很多人感兴趣的是基因水平的，于是，公开释放了功能，详细见：汇总 | 转录本表达矩阵 到 基因表达矩阵 https://mp.weixin.qq.com/s/JPM7ofuqZcKPZjySL7w5lA

首先感谢CJ大神能够花时间在RNA-seq插件的开（da）发（bao）工作上（再也不能push作者了）。虽然他本人经常自嘲只是在wrap，但这一系列插件足够消除seq新手入门的门槛。我相信新手只要顺着这个汇总操作，不需要命令行，每个人都能完成seq的RNA定量表达分析（只要你肯）。当然从bioinformation研究的角度上来看，这些插件效率不够高，也没办法进行大规模seq定量（>10），更无法自由定制化。但是对于那些只是做初步挖掘获取线索的科研人员（例如用新方法挖掘已经存在的seq数据），或者是只想做6-10个样本的小型课题组来说（需要一套seq数据来讲故事的时候），这套插件的帮助是非常巨大的（这也是作者的本意）。

接下来我会根据CJ大神给出的步骤，分别给出TBtools和命令行的实现方式从数据查询、下载、转换、质检、修剪、定量、表达矩阵的全套流程。希望每个坚持下来的人能走出自闭，顺利完成seq数据的定量分析。

数据获取

首先我们需要找到一个数据集下载（如：PRJNA358808 或者 SRP095684）。通常我们可以去NCBI或者ENA去搜索关键字查找到相应信息。下面分别介绍这两个数据库获取ftp下载地址的方式。

NCBI

NCBI查询地址如下：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=prjna358808
看到一共有24个runs，点击右上角的”send to“

这里选择保存为文件，格式选择完整的XML文件，最后点击create file下载.

image.png

在TBtools打开SRA XML to Table tab，分别按照要求填好xml文件和输出路径，之后点击确定。

可以看到所有下载地址已经被汇总在一个表格里了。

需要注意的是，由于TBtools默认保存的格式是txt，这里会提示你格式不匹配，选择是直接打开就好了，excel会自动识别文件的。

ENA下载地址获取方式

同样是在ENA查询，地址如下：
https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/text-search?query=PRJNA358808
这里选择run可以看到所有SRR列表

点击run

选择最大（50）

复制到excel里，默认会分成2行

选择SRR这一列

这里还是按照填入对应的信息即可，如图：

点击开始，该插件会把你输入的所有SRRnum的下载信息全部汇总在一个叫SRR_download_info_table的excel文件中。

这样，你就获得了所有SRR的下载地址，值得注意的是，这个表格数据很奇怪。命名是双端测序的数据，但fastq居然只有一个文件。

正常的双端测序应该有两个文件的
保险起见我们还是下载所有SRA文件，再用插件把SRA转为Fastq吧。
另外，ENA好像没有整个实验的描述，我们还是得去NCBI查看整个实验的method和sample。地址如下“
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP095684&o=acc_s%3Aa

最后，这些步骤似乎都没用到命令行……好像也没有必要