自2019年12月新冠肺炎疫情发生到如今全球呈多区域爆发情况下，各国监管机构和IVD企业陆续采取积极措施。为积极应对新冠肺炎疫情，国家药监局于第一时间启动应急审批程序。1月20日，器审中心起草《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》，并于2月12日在中心官网率先对外发布。
世界卫生组织（WHO）于1月8日修订了《紧急使用清单（EUL）程序》（Emergency Use Listing Procedure），并于2月28日发布了《SARS-CoV-2核酸检测试剂申报要求指南》。FDA于2月29日发布指南《公共卫生突发事件期间在经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室于紧急使用授权（Emergency Use Authorization，EUA）批准之前进行2019新冠疾病诊断检测的政策》。3月16日，FDA更新了该指南，增加了无需提交EUA的政策和适用生产商的政策。
本文将对中国、美国及WHO上述文件中对新冠核酸检测试剂的要求进行对比分析。
一、文件适用范围
我中心发布的审评要点针对我国IVD生产企业，用于申请产品在境内上市的注册资料申报。WHO指南面向的是全球企业，目的是帮助制造商提交WHO EUL流程申请，该EUL流程旨在加快公共卫生突发事件期间所需IVD的可用性，并基于安全有效性数据等基本质量要求，协助感兴趣的联合国采购机构和成员国确定在公共卫生突发事件期间使用特定产品的可接受性。WHO提供的通道适用于全球采购，也因此在指南的临床证据中描述了入组说明书中声称的各类人群及各使用地区的样本。美国FDA指南提供了灵活的加速新冠检测的方式，对于经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室，使用该实验室开发的试剂，在完成产品验证后、申请EUA之前（一般不超过申请之前15个工作日），允许开展新冠病毒的临床样本检测。对于州/地区授权的辖区内经CLIA认证可开展高复杂性检测的实验室，使用该实验室开发的试剂检测样本，在州/地区政府为检测结果负责的前提下，可无需向FDA提交EUA的申请。对于商业生产商，在其完成产品验证后，申请EUA之前（一般不超过申请之前15个工作日），允许销售试剂给实验室进行样本检测。FDA指南对上述实验室或生产商开发产品的验证要求是一致的。
二、质量管理体系
WHO EUL程序包括质量管理体系审查和上市后监管计划，以及评估产品安全有效的档案审查。我国应急审批过程中，对申报产品进行技术审评、质量管理体系考核和上市后监管，与WHO要求一致。提交给WHO EUL程序的IVD必须在适当、充分且有效的质量管理体系（QMS）下制造。因此评估申报产品的第一步就是对制造商的QMS文档进行评估，只有在充分证明申请人是制造商，且有适当的QMS证据和所需的制造能力时，才可继续审评流程。我国这次应急审批工作与WHO相似，器审中心在收到国家局转来的应急审批名单后，第一时间与相关企业联系，了解产品和申请人的QMS情况，确认产品是否在有效的QMS条件下生产。相关省局迅速启动医疗器械注册质量管理体系核查，并将核查进度和结果反馈器审中心。我中心发布的新冠核酸审评要点中，亦强调了“企业应提交在符合质量管理体系的生产环境下生产的试剂盒进行的所有性能验证的研究资料”。美国FDA两版指南则均未提及质量管理体系相关要求。
三、应急审评产品证据
WHO EUL程序中产品档案要求提交产品描述信息以及安全有效性证据。对申报的新冠试剂，如未进行充分的分析和/或临床性能研究，亦可接受合理的人工样本模拟研究，在初步证据可支持产品的安全有效性的情况下，可不进行法规要求的全部研究。我国在应急审评中，亦认可有限性证据，可通过产品上市后作业的形式，对目前有一定安全有效性证据，可基本保证产品质量，但证据尚不完全充分的情况下，批准应急产品上市。FDA EUA签发需要的有效性证据水平为“可能有效”，低于FDA日常产品批准的“有效”标准。
四、产品质量控制要求
WHO和我国均要求明确申报产品的主要原材料/成分信息，但WHO仅要求简单描述，而我国要求明确主要原材料的验证过程和质量控制标准，并将主要原材料的来源和质量控制标准在产品技术要求附录中载明，以医疗器械注册证附件的形式进行固定，以确保产品主要原材料的稳定，使其可持续符合经验证的性能和质量。另外我国要求建立稳定的企业参考品，用来进行日常生产过程中产品的半成品检验和成品检验。通过原材料和企业参考品的要求，保证了生产原料、半成品和成品的质量均稳定可控。 我国要求新冠核酸检测试剂盒中应具备质控体系，包括阴性质控品、阳性质控品和内标，其应参与样本处理、核酸的平行提取和检测的全过程，以对整个提取和PCR扩增过程、试剂/设备、交叉污染等环节进行合理质量控制，避免检测过程中的假阴性和假阳性。WHO和FDA均未对试剂盒中的质控体系进行要求。
五、性能要求
1. 核酸（RNA）提取/纯化性能
WHO和FDA均未要求研究配套提取试剂的性能。因为新冠病毒属于RNA病毒，需要进行提取分离得到病毒RNA方可进行逆转录和扩增检测，且采集样本常为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等，可能存在病毒载量低、PCR抑制物影响反应进行等问题，所以提取并富集目的核酸，纯化去除PCR抑制物尤为重要。我国要求对配合使用的核酸提取/纯化试剂的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证，并将经验证的提取试剂在说明书中明确，保证了检测反应顺利进行和反应体系的可控性。但是特殊方法学的产品如实验设计无核酸提取步骤，在性能验证充分且符合要求的情况下，也可以获得批准。
2. 不同区域病毒样本包容性的验证
目前已经发现新冠病毒产生了149个突变位点，如检测试剂引物探针结合位置序列发生突变，可能会影响检测结果。对此，我国要求在引物、探针设计阶段，应通过序列比对和试验等方式，对病毒进行包容性和特异性（如交叉反应）的评价，选择最佳的引物探针组合。并且在性能评估中应至少验证包括具有时间和区域特征性的10个不同来源的病毒样本，以尽量证明检测试剂可以覆盖检测不同病毒株。FDA仅要求采用计算机进行序列比对分析包容性，未要求通过真实病毒进行试验验证。WHO对包容性相关序列分析和试验验证均未进行要求。
3. 精密度
精密度是检测试剂的重要性能，我国明确精密度评价不可仅采用模拟样本，应包含若干临床样本，精密度评价试验应包含核酸分离/纯化步骤，并且设置了各样本的精密度评价标准。通过明确具体要求，确保精密度验证的充分性。WHO并未进行上述要求，仅概括性地描述了精密度影响因素和样本浓度水平。FDA指南未提及精密度的要求。
4. 计量学溯源性
WHO表明目前尚无新冠核酸检测的国际标准品，一旦建立相关国际标准（IS）或参考物质，应根据已建立的IS或参考物质对试剂进行校准，目前阶段，试剂应溯源至经验证的新冠参考物质（例如，来自国家控制机构的参考物质）。WHO亦要求制造商参加一项合作研究，以评估临时性IS。这与我国情况基本一致，在审评过程中，我们要求采用科学的方法标定病毒滴度，进行最低检测限相关的量值研究。中检院建立了应急用国家参考品，可评估各申报试剂的相对灵敏度。但是中检院并未对其参考品进行定值，所得结果仅可体现各申报试剂平行比对的信息，无法体现具体的病毒量值。目前我国批准的新冠核酸检测试剂均为定性检测试剂。FDA指南未提及量值研究。
5. 最低检测限
我国和WHO、FDA对最低检测限研究方法的要求基本一致，均为采用梯度稀释，多次重复测定获得具有95%阳性检出率的浓度水平。但是WHO允许使用体外转录或装甲RNA等模拟样本进行最低检测限研究，而未要求必须使用病毒样本或核酸提取液。FDA指南接受采用RNA或灭活病毒掺入人工基质或真实临床样本基质，但是未表示接受体外转录或装甲RNA等模拟被测物。我国要求至少采用不同来源的3个具有代表性的新冠病毒样本或假病毒和另外3个不同真实临床样本或核酸提取液分别进行最低检测限的确定和验证，以充分研究最低检测限这一关键性能。
如果适用多种基质样本类型，FDA推荐在EUA申请中仅提交采用最具挑战性临床基质进行的最低检测限研究结果。例如，若试剂可检测痰液、支气管肺泡灌洗液、鼻咽拭子等呼吸道样本，实验室应仅提交痰液样本的最低检测限结果。我国和WHO均要求，对每种声称的样本类型均应进行最低检测限研究，相对FDA，我国和WHO该要求更加严格。
6. 分析特异性（干扰试验和交叉反应）
WHO要求对于常规PCR检测试剂或者测试前使用完善的提取方法的试剂，检测呼吸道或血浆样本时可不必进行干扰研究。对于新的提取方法或等温扩增等非常规PCR产品，需要对潜在的干扰物进行测试。这一点与我国要求不同，因为新冠病毒核酸为RNA，其检测过程中需要进行逆转录和PCR扩增两个关键步骤，逆转录酶比普通DNA聚合酶更易受到其他物质干扰，所以为充分发现潜在的干扰物质，我国要求所有试剂均应进行干扰研究。对于推荐的潜在干扰物质，WHO和我国要求基本一致，但是WHO仅描述了干扰物质的类别，而我国对干扰物质类别和具体物质/活性成分均采用表格列举的方式进行了明确，有利于申请人执行该要求，亦可保持审评尺度一致。对于推荐的交叉反应物质，WHO和我国要求的病原体大部分相同，但亦各自存在一些不同的病原体，这可能与不同地区出现的感染病原体种类不同有关。值得一提的是，我国对于交叉病原体要求明确了种类和具体型别，更加具体，且试验验证的病原体种类相对较多，确保了验证的充分性。
WHO明确了干扰样本应一式三份进行测试，避免单次检测带来的随机误差。对于病原体交叉反应研究，建议通过将培养的分离物掺入阴性临床基质中来制备测试样品，避免申请人直接采用病原体培养物而忽略样本基质带来的影响。在交叉反应研究中，WHO要求包括实验室测试和计算机分析两种方法。对于交叉反应可能性较高的病原体，应进行这两种分析，而对其他可能的交叉反应病原体，可仅进行计算机分析，如果计算机分析发现序列同源性较高等交叉风险，再根据需要进行实验室测试。这样可以验证更多潜在交叉的病原体，而不显著增加企业的试验负担。另外对于计算机分析表明与测试引物/探针同源性较高的微生物，应进行干扰研究，验证高水平干扰病原体存在的情况下，是否对弱阳性新冠样本的检测产生干扰。这些要求均值得我们借鉴。
FDA指南中未提及干扰试验，仅对交叉反应进行了要求。FDA认为计算机分析引物探针与常见呼吸道菌群及其他病毒等病原体的序列同源性对最初的临床应用是充分的。另外，FDA推荐实验室应遵循公认的实验室程序，对待测样本类型的其他交叉反应进行测试。相比之下，FDA对特异性的要求最为简单和概括。
7. 适用机型
由于新冠核酸检测试剂需要采用实时荧光定量PCR仪进行检测，不同厂家和型号的仪器存在差异，可能会导致检测条件和扩增效率不同。所以，我国要求对于适用多个机型的试剂，应提供产品说明书【适用机型】项中列出的所有型号仪器的性能评估资料。WHO和FDA对性能评估的要求均未考虑机型因素,FDA可能考虑适用仪器一般是封闭系统，所以未提及。
8. 样本类型
WHO要求每种样本类型（例如不同的拭子类型或病毒转运介质等）应进行基质等效性研究，最低检出限和临床特异性研究。我中心审评要点规定“不同样本类型应分别进行性能评估验证。”该要求较WHO要求更加严格。但是一般我们要求的不同样本类型为咽拭子、痰液和肺泡灌洗液等。在考虑最小负担原则的前提下，我们并未要求不同的拭子及转运介质均进行全性能评估。FDA指南并未考虑不同样本类型和基质的验证，仅在最低检测限研究中表示应采用最具挑战性临床基质进行试验。
9. 阳性判断值
阳性判断值即指通过试剂检测结果判断是否存在病毒核酸的临界Ct值，是结果判断的依据，阳性判断值设置的合适与否，直接关系到是否会出现假阳性和假阴性，我国要求提交阳性判断值确定资料，并对该研究提出了具体的要求。WHO和FDA均未要求提交该资料。
10. 样本稳定性
WHO要求在每种条件下，应至少测试10个样本的稳定性。因为考虑样本稳定性属共性特征，与样本例数关系不大，我国并未要求样本稳定性研究的例数。
11. 试剂稳定性
WHO和我国均要求进行试剂稳定性研究，并且在时间有限的情况下，可提交未完成的实时稳定性试验资料，资料中应包含研究计划和当前的研究结果。企业应在产品上市后继续完成实时稳定性研究。
12. 主要生产工艺及反应体系的研究资料
我国需提交产品的主要生产工艺确定的研究资料，同时提供反应体系的详细研究资料，评价产品生产和使用过程的科学性，WHO和FDA均未要求提交该资料。
13. 测试能力
WHO要求提交测试能力相关资料，描述申报产品的样本通量/容量，执行测试所需的时间（从临床样本采集到获得检测结果）以及每台仪器每天可进行的测试次数。我中心在与企业沟通中均会了解产品测试通量和速度等信息，但是未将该内容写入审评要点，未将其作为申报资料的一部分进行提交。在疫情防控的紧急状态下，将审评资源集中在通量高、速度快、易于推广应用的产品上，是更加科学高效的选择。
六、临床试验要求
1. 临床试验机构
WHO表示临床试验可未完成，但是必须具有部分临床证据以确认临床性能。WHO和FDA均未对临床试验机构进行要求。我国要求在三家以上临床试验机构进行临床试验。如临床试验机构条件允许，推荐多家生产企业的试剂盒在相同的临床试验机构共同验证。
2. 临床样本要求
WHO要求纳入各使用地区的样本，理想情况下应进行50个前瞻性阳性样本研究，如前瞻性研究难以实现，亦可接受回顾性研究。至少检测25个真实的临床阳性样本（前瞻性和回顾性），其余样本可以是向阴性临床基质中添加新冠病毒制作的人工样本，临床特异性评价需要收集有症状个体的至少100份阴性标本。FDA考虑阳性样本难以获取，推荐实验室通过一系列人工样本来确认临床性能，要求至少检测30个反应性人工样本和30个非反应性样本，反应性人工样本可以通过将RNA或灭活病毒掺入剩余临床样本中制备。对于CLIA认证实验室开发试剂，在等待EUA申请结果的同时，FDA建议实验室采用一个经EUA授权的方法，对申报试剂检测的前5个阳性和前5个阴性临床样本的结果进行确认。我国建议入组确诊病例不少于200例，排除病例不少于300例，可为临床样本或者经提取后的核酸提取液。可见我国要求的临床试验例数更多且均要求真实临床样本，所获得的临床证据更加真实和充分。WHO和FDA对制备的人工样本浓度均进行了要求，应有较高比例的检出限浓度样本，同时具备覆盖检测范围的样本。由于我国要求临床试验均采用真实临床样本，所以无法精确配制具体浓度，主要通过覆盖各类适用人群，实现样本浓度的多样性。
3. 临床试验入组人群
WHO要求纳入说明书声称的各类人群，但是未具体描述适用人群的概念和范围。我国明确了适用人群为新冠肺炎疑似病例，要求入组确诊和排除病例，包括部分前期核酸检测阴性的确诊病例，解除隔离和符合出院标准的病例，入组病例中不同临床严重程度、不同病程阶段的患者均应有一定的例数。可见我国要求的临床试验入组人群更加具体和全面，覆盖了产品在实际临床应用中的所有情况。FDA指南未对临床评价入组人群进行要求。
4. 临床试验对比方法
WHO推荐的对比方法是：对于临床样本，和FDA EUA或WHO EUL 列出的PCR检测进行对比；对于人工样本，与预期结果进行比较。FDA要求的临床证据包括人工样本和CLIA认证实验室在等待EUA申请结果时检测的10个临床样本（检测的前5个阳性和前5个阴性临床样本）。其中人工样本与制备的预期结果进行比较，临床样本采用一个经EUA授权的方法，对检测结果进行确认，如果任何一个结果不符，实验室应通知FDA，并且采取其他合适的措施，例如终止检测患者样本，并发布声称之前检测结果可能无效的更正测试报告。我国要求临床试验应选择已上市的同类产品作为对比产品，同时，考虑考核试剂检测结果与临床确诊/排除结果进行对比。其中临床确诊病例应依据卫健委发布文件的新冠感染病例确认程序判定，不建议采用某一试验地点的单次试验结果作为确认结果。可见我国要求的临床试验对比方法综合对比试剂和完整的感染病例确认程序，结果更加准确。
5. 临床试验结果的统计分析
WHO和FDA对临床结果的统计分析，仅要求计算一致性百分比。我国要求的统计分析对结果数据的挖掘更加充分，具体分析内容包括：符合率、临床灵敏度、临床特异度及其置信区间，人口学分析，不同人群的分层统计，不同样本类型的分别分析以及不一致结果的分析。
七、总结
综上可以发现，我国对新冠核酸检测试剂的要求比较充分和明确，在疫情防控的应急状态下，我们接受有限的证据，但在可实现的情况下，要求安全有效性证据尽量充分。并且通过审评要点明确具体要求，利于申请人在产品验证确认过程中一步到位，不走弯路，同时有利于保持审评尺度的一致性。同时，我们也注意到，国际监管机构存在部分先进经验，值得我们学习和借鉴。
应急期间，各国可能发布新的新型冠状病毒核酸检测试剂相关政策，本文所引参考文献截止到2020年3月25日。
参考文献:
[1] Policy for Diagnostic Tests for Coronavirus Disease-2019 during the Public Health Emergency. FDA March 2020
[https://www.fda.gov/media/135659/download]
[2] Instructions for Submission Requirements: In vitro diagnostics (IVDs) Detecting SARS-CoV-2 Nucleic. WHO February 2020[https://www.who.int/diagnostics_laboratory/200324_final_pqt_ivd_347_instruction_ncov_nat_eul.pdf?ua=1]
[3] 关于发布《2019新型冠状病毒核酸检测试剂注册技术审评要点》的通告（2020年第4号）国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心 2020年2月
[https://www.cmde.org.cn/CL0004/20447.html]
文章来源：国家药监局医疗器械技术审评中心 审评六部/李红然 董劲春
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