3. 蛋白质谱的原理及使用(4)

说明:此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成,侵删。该课程由中国农业大学生物学院的李溱老师所授。


主要知识点
--质谱仪的使用与维护
--纳升液相系统的使用与维护
--液质联用系统的检查和保养
--质谱运行状态的评估


质谱仪的使用与维护

之前我们讲到了质谱仪主要分为以下五个部分,那么我们就分别针对这些部分来讨论一下使用中可能遇到的问题。

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质量分析器

包括mass analyzer和mass filter。对于质量分析器的使用和维护,主要有以下几个要点:

1、 对分辨率和质量准确性进行校正。

这个怎么做呢?最简单的办法就是,每天我们对数据采集中的背景信号进行评估。

比如我们发现,每天质谱图的背景噪音中445.12003处都有一个峰,这应该是空气中硅酮或者装修材料导致的。通过评估这个峰的宽度和质量准确度,我们就能知道质谱的质量轴不是发生了漂移。除此以外,还可以用质量校正液对质量准确性进行评估,这个根据质谱仪的现状,可以每天做,或者每周来做。

2、 评估灵敏度

最简单的办法是做一个标准品,看看它的信号强度有多强,通过这个来评估质谱仪的灵敏度。如果发现灵敏度变差了,我们就要考虑是否有污染,或者某个参数设置错误。

3、 检测质量隔离的准确性以及离子传输/碎裂效率的评估。

这对QE质谱仪来讲,可能是更加明显的问题。在质谱仪做二级的时候,我们是利用四级杆对母离子进行选择,如果质谱仪的设置参数有问题,它对母离子的选择就会发生偏差。比如我们想让它选择质荷比为300的离子,结果它选择出来的是298的离子,就会产生错误。

还有一个问题,质谱仪不能把所有质荷比为300的离子都选择进来,在传输过程中会产生一些损失。针对传输效率,我们需要通过一些实验来分析。最简单的办法还是做一个标准品,通过标准品来看二级谱图的质量与之前运行得比较好的数据相比,是不是变差了。如果变差则说明离子传输的效率可能下降了,就需要通过校正液等,对参数性能进行校正和评估。

比如QE,就有专门的校正和评估程序,来检测传输效率是不是发生了下降。如果下降了,就需要清洗离子源、四级杆,或者传输系统,恢复它的性能。

真空系统

1、 每天需要检查初级真空和高真空的读数

这个是非常重要的,最好每天检查两至三次。质谱仪中的大部分问题都是与真空系统有关的。

2、 每天检查泵油液面、颜色和温度。

为什么需要检查泵油呢?下图红圈标记的地方是QE机械泵的一个窗口,可以用来检查泵油的颜色和液面。窗口旁边有两条线,分别是液面上限和下限,停机状态的时候泵油会高一些,显示比上限的刻度多一点,启动起来以后液面会下降一些。

如果泵油太多,泵会“打嗝”,从废气管排出多余的泵油;泵油太低的话,散热会出现问题。所以需要保证泵油是在两个窗口线之间的。

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泵油的颜色是另外一个很关键的指标,它能体现出泵油受污染的程度。新的泵油,比如现在常用的GS495合成泵油,未使用前是黄色的,随着使用时间增长,它会慢慢变成褐色。其它质谱仪,可能会用到Inland19泵油,未使用前是完全无色透明的,随时使用时间的增长,它也会变成褐色。当泵油变成褐色以后,实际上是在告诉我们,它的使用寿命到期了,应该换掉了。换泵油的频率通常是半年一次。

泵油的温度也是重要的指标。泵在工作的时候,泵壳温度在70℃左右,如果泵的温度过低,表示泵的负荷不足,如果温度过高,则很可能泵的某个部位发生了严重的磨擦或者摩损。有一定经验以后,我们可以用手摸一摸泵壳,如果感觉有点烫手,那个温度就是对的,如果非常烫手,那可能泵已经过热运行了。

3、 每周开震气阀震气15-30min

这个工作也很重要。如果不震气,很可能会导致泵的早衰。为什么会出这个问题呢?我们先来看下图:左侧整体图中红色框起来的地方就是泵的入口,右边是它放大以后的照片。

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泵的入口对着的就是ESI的喷针,喷针会以200nL/min的速度往泵里面喷乙腈和水,这些乙腈和水被泵抽走之后,就会通过废气管进入到泵油中,乙腈可以与泵油混溶,导致泵油越来越稀,而水是不会与泵油混溶的,只会与泵油产生一种“水火不相融”的效果,使泵油乳化。这些很热的水会在泵里面流动,腐蚀铸铁的泵头,导致泵头的缝隙变大,但泵的工作效率下降。可见,定期震气是必须要做的重要工作。

那么震气是怎么操作的呢?机械泵上会有一个震气阀,震气阀的目的是将新鲜的空气从此处抽到泵里面去。空气进入泵以后,会将泵油中的水蒸气(或者说湿气)带走,通过废气管排出来。水分排出来以后,泵的腐蚀就会得到控制了。

另外,我们要知道,与泵油互融的乙腈是没办法除掉的,所以我们需要每半年换一次泵油,来减少乙腈对泵油的污染。

4、 定期检查漏油情况

泵漏油是经常发生的,尤其是使用超过五年以后,漏油基本上是必然的。这个油会漏到哪儿去呢?通常比较好的质谱仪,比如QE,会有一个接油的盘子。其实当我们看到盘子里有油的时候,油已经漏了很久了。所以我们应该经常趴下来看看油壳的底部是否有油渗出来,如果有,就应该及时维修,防止因为漏油过多,造成泵里缺油,导致泵运行的质量就会越来越差,最后机械泵就会被烧坏。

5、 注意机械泵和涡轮泵运行噪声的变化

这是一个很微妙的过程。我们知道,新买来的机械,运行的时候噪音非常小,运行起来很安静。随着仪器的老化,它的声音会逐渐变大。但如果运行过程中噪音突然变大,则表示泵出现了一些故障,这时就需要关注真空度或者其它一些参数,看看泵的性能是否发生了变化。

尤其是涡轮泵,运行时如果出现了一个非常尖的类似哨音的噪音,就说明涡轮泵出现了一些故障,需要密切监视涡轮泵运行的真空度或者其它参数。如果发现了故障,可以第一时间排除,而不要等整个泵都坏了再维修,那就很耗时间了。所以泵噪音的变化,是一种快速的信号,可以提醒我们注意监视泵的运行情况,尽早排除故障或进行维修。

6、 检查仪器运行日志(log)中记录的运行参数

QE质谱仪每15分钟会自动记录一次仪器的运行参数,这个记录我们可以每天或每周查看,如果发现里面的参数突然发生了大的波动或变化,则表明相关的设备可能发生了故障,特别是与涡轮泵有关的电压、温度或工作电流等。

另一个我们常见的问题就是真空度报警。各个质谱仪都有可能出现真空度过高或过低的问题。泵损坏了会直接导致真空度过高。另外,毛细管离子传输的入口受了损伤,变大了,或者说没有拧紧,导致漏气,也会导致真空度过高。反之,当毛细管被堵塞时,会导致真高度过低。(后面会举一个例子,一只蚊子把毛细管出口堵住了,拿走蚊子以后真空度恢复正常。)

离子源和离子传输系统

1、 喷针的清洗

喷针的洁净度对喷雾稳定性的影响是很大的。前面介绍过,喷针是非常细的,长度大概是3-5mm,针尖的内径和外径不到10μm。样品通过针尖喷出去的,因为这里有高压,而且毛细管会有300℃的高温,如果样品在针尖处残留,我们肉眼是看不到的,但会导致喷针形成不了连续的喷雾,而是会形成断断续续的喷雾,或者很小的液滴。如果出现这种情况,就表示喷针的针尖污染了。

如何清洗呢?通常是用甲醇,也可以用异丙醇与水的混合溶液冲洗针尖,如果还是没办法把污染物洗下来,就只能换一个喷针了。质谱仪通常用的是不锈钢的喷针,这种喷针非常软,清洗的时候一定要小心,否则容易把喷针碰歪,就不能再继续使用了。

下图是一个比较极端的例子,一只蚊子跑了进去,把离子源出口堵住了,还把针尖碰断了。

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2、 离子传输毛细管的清洗

传输毛细管其实就是从大气压到质谱仪真空状态的一个渐变。进入质谱仪的所有样品,离子、空气、溶剂分子,都要经过它,所以它很容易发生污染。另外,毛细管的洁净度又会影响粗真空,如果毛细管很脏,真空度就会下降,还会导致灵敏度的降低。

通常情况下,毛细管的温度是很高的,我们需要把它冷却以后,再拆掉清洗。

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上图红色圈出来的就是毛细管的位置。拆掉以后的毛细管如下图:

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毛细管开口处的直径通常不到1mm。将毛细管组装上去以后,如下图,红色和橙色圆圈分别标记了毛细管的入口,以及它穿过质谱仪的出口。离子通过毛细管,进入到S-Lens。

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3、S-Lens的清洗

S-Lens可以看作是离子源的一部分,功能是聚焦离子。它的结构是由13片不同的铁片组成,通过下面的横截面图,我们看到它的每个铁片上有一个圆圈,而且这13个圆圈的大小是不一样的,靠左侧的圈大一些,靠右侧的小一些,离子是从左边进来,往右走的过程。

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当离子进入S-Lens以后,空气中其它的污染物也容易一起带进来,开始经过的是大圈,通常不会堵在圈上,再往后圈变小,空气中的污染分子就容易打到这些小圈上,使S-Lens发生污染。所以需要定期清洗。比如下图中拆下来的这个铁片,中心的圈周围那一片灰色的东西,就是污染物堆积而形成的。

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清洗的方法是使用1% Liqui-nox超声清洗,这是一种非常好用的清洗液。S-Lens的清洁度对灵敏度的影响是很大的,尤其是在做小分子的时候,S-Lens的污染很可能会导致信号丢失。所以如果发现质谱没有信号出来,可以先清洗一下S-Lens看看。

气体系统、计算机及供电系统

1、 气体系统

质谱仪在碰撞池里是需要充高纯度的氮气或者氦气的,这部分由供气系统来完成。一般情况下,我们要求4个9(即气体的纯度大于等于99.99%)的高纯氮或者高纯氦,在保证纯度的前提下,还要保证有一定的压力。

2、 计算机

目前高分辨质谱仪产生的数据量是非常大的,一小时产生500M-1G的数据很常见,所以每天可能会产生20G数据,一个月就有600G,硬盘很容易装满。所以我们一定要注意定期备份和删除数据,保证有足够大的硬盘空间来存放我们的实验数据。

3、 供电和空调系统

液质联用系统需要一个稳定的电源。如果供电系统不稳定,会导致很多问题。比如,电源不稳定会引起零地电压不稳,导致液相色谱不能给质谱仪准确的开始信号,使得它们无法同步,最终导致液相色谱与质谱的通讯发生错误。

另外,实验室的温度、湿度和洁净度,对于保证质谱仪在一个稳定的环境中运行,也是非常重要的。

散热系统

最后,对质谱仪的散热系统也需要进行除尘处理。QE有一个通风口,用来往里抽空气,达到通风散热的效果。通风口也可能被空气污染物堵塞,导致散热效率下降,所以需要定期清洗。

纳升液相系统的使用与维护

上面介绍了质谱仪在使用中的注意事项,接下来我们学习一下纳升液相色谱的使用与维护。

流动相和洗针液

1、流动相:纳升液相色谱有一个很大的特点,就是它的流动相消耗量非常少。我们可以计算一下,它的流速是在0.2-0.3μL/min,所以一个小时只会消耗十几微升的流动相,一天的用量也不会超过0.3mL的量。而一个溶剂瓶通常能装30mL的溶液,算下来可以用100天。

但是我们却不可能真正用到100天。因为流动相里的一些成分会挥发,比如乙腈、甲酸,而且水相可能会被污染,这些都会导致流动相变质。因此,我们需要严格注意并定期更换流动相,来防止流动相的挥发和微生物的滋生。

我们见过一些比较极端的情况,把溶剂瓶里的流动相倒出来后,发现瓶身上会有一圈白道,这就是长时间不更换溶液,里面长了大量的微生物形成的,这些微生物的代谢物会严重污染样品,造成分析结果很不准确。

2、洗针液:在使用洗针液时,要确保样品不被弱洗液洗脱,使用的强洗液要能彻底清洗进样系统,防止残留和交叉污染。

进样瓶

进样瓶的材料很重要,要求对样品的吸附很弱,所以通常使用塑料瓶,它比玻璃瓶的吸附力更弱一些。而且应该选尖底的塑料瓶(比如像下图这样的),可以保证最后一点溶液也能被进样器吸走。尖底瓶可以将最后残留的溶液控制在4μL以内。

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另外就是对自动进样器的温度进行控制,通常控制在8℃左右。可能你会问,为什么不能控制在4℃呢?4℃的时候,空气中的水分会在进样器内部凝结,造成进样器结露,8℃就没有这个问题。

这里需要特别注意的是,做纳升液相色谱,通量是非常低的,往往一天只能出十几个样品,也就是说,虽然我们的自动进样器是96位的,甚至更多,可以容纳很多样品,但是并不等于自动进样器可以当成冰箱来使用。如果你的样品比较多,在前处理完成后,都应该放到冰箱里,而进样器里只放一天能做的样品数,比如十几个。没必要把更多的样品都放到自动进样器里,这样可以缓解进样器的负担,也能避免样品因为自动进样器发生了故障或者温度太高时产生降解。

系统压力

系统压力是非常重要的部分。我们先来看看下面的柱压曲线图:

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柱压曲线可以很直接地反映出液相色谱系统是否正常。有操作经验的小伙伴都知道,液相色谱系统很容易发生堵塞,检查到底是哪里堵了,为什么会堵,都是非常头痛的事。那么,如何来及时发现色谱可能会出现的堵塞或者故障呢?这时候我们就可以好好利用柱压曲线来分析了。

上图中上面那条是正常情况下的曲线,分为两段,第一段(最左侧有两次大的起伏那一段)叫traping。这段实际上就是保留样品打到Trap柱上,用高水相(99%的水)和比较高的流速(2-5μL/min)来冲洗,把样品中的盐和其它杂质除掉,于是形成的这么一段压力变化图。

然后我们用0.2μL/min的速度开始跑梯度,跑完梯度就产生后面那一段较长的曲线,我们会看到压力会呈现出逐渐升高,再快速降低,再升高的过程。

第一段traping区,产生了一小段平稳的峰,这表示样品的盐已经被除掉了。而像下面那条曲线中的traping阶段,峰型明显不如第一张图平稳,出现了压力升高的现象,这表明样品中可能会有杂质在trap过程中被流动相慢慢地带到柱子里,而且会留在柱子上,导致柱上局部地堵塞。这种情况下说明样品前处理是有一些问题的,样品处理得不是很干净。

如果像第二张图中显示的那样,在traping阶段出现了压力变高的现象,则很可能样品中的杂质进入到了分析柱中,把分析柱堵了。这种情况下,在做完实验后,可以用相对高浓度的乙腈彻底地冲洗色谱柱,把里面的杂质冲洗干净。

在第二段,压力应该是慢慢地升高,然后降低,再升高的。因为99%水相的时候,压力是比较高的,而乙腈混合物中当水的浓度为80%-90%的时候,压力会慢慢上升,之后,随着乙腈浓度的升高,压力会有下降的过程,最后再回到比较高的压力水平。如果整个柱压曲线符合以上的变化规律,则说明整个过程是没问题的。但如果样品压力突然大幅度降低,表示管路的接头可能发生了断裂,这个也是需要特别我们留意的信号。

色谱柱超压和漏液

色谱柱如果压力过大,就超压报警。那么超压产生的原因可能有哪些呢?

  • 酶解以后没有离心,或者胶没有处理好,样品颗粒或胶颗粒进来以后,将色谱柱堵塞;

  • 有杂质把进样六通阀损坏了,这些杂质可能会从六通阀里被冲出来,堵住柱子;

  • 没有裁剪整齐的石英毛细管。

说到石英毛细管的裁剪,这绝对是个技术活。我们知道,做柱子的时候要用石英毛细管进行连接,而连接处是不能直接拧到色谱柱的接头处的,需要通过一个套管,先把毛细管切了,再用套管来接。切割毛细管的工具通常是陶瓷片,切的过程中很容易产生一些碎片。而且毛细管的内径只有100μm多,外径也只有360μm,这么细的管子,切的时候需要内管和外面包覆的聚合物层一起切,这种聚合物材料的包覆层也容易切出毛边。这些毛边和碎片,很容易进到色谱柱里,造成堵塞。

这个问题怎么解决呢?我们需要升级一下裁剪工具,比较建议大家使用下图的毛细管切割器。价格有点贵,3000多人民币,但切出来的口是非常整齐的,如果经常需要用的话,可以考虑买一个。用毛细管切割器可以很有效地解决毛边的问题。

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除了超压,另一个可能出现的问题就是漏液,这个我们该怎么检查呢?常用的办法是用pH试纸。因为我们使用的99%的水和0.1%的甲酸,是酸性溶液,我们用pH试纸把整个管路接口检查一遍,如果发现试纸变成红颜色,则说明有漏液。

还有一个需要我们注意的问题,就是纳升液相色谱的套管和接头。我们先来看一张实物图:

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通常,液相色谱仪的管路都是1/16’的管路(即管路内径是1/16’英寸,大约1.6mm),而石英毛细管的外径是360-380μm,显然它们是不兼容的,也就是说,我们如果直接将毛细管装到管路接头处,会留有很大的缝隙,所以需要套管才能把两者紧密地接上。在进行管路连接时,我们需要保证套管的前沿与毛细管的前沿是并齐的,且是没有缝隙的。一旦有缝隙,会形成一个叫“死体积”的空间,导致色谱峰的变化。

另外,纳升液相色谱中使用的三通接头是1/32’的管路(直径0.8mm),与1/16’的管路也不兼容,所以还需要换一个1/32’的套管,再往上连接。

液相色谱管路使用的接头分两种,一种是PEEK(聚醚醚酮)塑料接头,它能承受的最大压力是5600 psi,另一种是不锈钢接头,可以承受的最大压力为10000 psi,这两种接头承受的最大压力是不一样的。我们在设置液相色谱系统压力时,需要考虑的是承受压力最弱的那个环节。比如,当色谱系统的任何一个接头使用了PEEK材料,则整个系统的压力都不能超过5000 psi,否则当压力过大时,PEEK接头处的套管就很容易从接头处蹦开,导致漏液。我们在设置色谱的系统压力时,一定要确认清楚所有接头的类型。

液质联用系统的检查和保养

接下来我们来说说液质联用系统该如何检查和保养。

每日检查

1) 实验室温湿度:如果实验室温度过高,比较空调坏了,则应该马上停止实验,否则,质谱仪很容易因为温度过高而造成测量结果不准。比如Q-TOF,过热了以后,它的TOF管长度就会发生变化,质谱质量轴就会飘掉,导致结果很不准确。

2) 机械泵油面、工作温度和油壳渗漏

3) 系统真空度(粗真空和高真空)

4) 质谱质量轴:检查我们常看的值是否发生变化,如果有变化,说明质量轴已经不准确了,应该立刻停下实验重新校正。

5)溶剂瓶沉淀检查:晃动并观察溶剂瓶下部是否有絮状沉淀,如果有则说明流动相在溶剂瓶里至少存放了一周以上,应该立刻换掉,甚至应该把溶剂瓶的滤头也换掉,因为滤头里可能会有很多的微生物,而导致样品的交叉污染。

每周保养

1) 质量轴校正:校正的频率根据质谱仪的不同而不同,例如QTOF,校正的频率可能需要更高一些,具体的频率要参考仪器商提供的手册说明。

2) 机械泵震气

3) 离子传输毛细管清洗

4) 流动相,洗针液更换

每月保养

1) 离子传输系统(S-Lens)的清洗

2) 离子传输性能评估和校正

3) 四级杆污染程度评估

半年保养

1) 更换机械泵泵油

2) 清洗四级杆

3) 色谱仪管路清洗:推荐一种“神仙水”,冲洗所有的管路,每次用量为20-50mL。它的配方是:水:甲醇:乙腈:乙醇 = 1:1:1:1

4) 色谱泵柱塞杆,密封垫渗漏测试:测试泵是否可以承受标称的压力,例如标称为10000 psi,那我们可以验证一下是否能做到。再比如,假设我们的方法设定是5000 psi,那我们跑一下试试是否会漏液,如果发现漏液,则说明该泵不能提供5000 psi的稳定压力,在此压力上由于它会漏夜,则流动相的流速测定也是错误的了。

5) 仪器除尘

6) UPS放电

7) 空调系统检修

如何评估质谱的运行状态

TIC图的峰强和峰宽

质谱系统的运行状态我们可以通过TIC图来判断。那么,什么是TIC图?TIC(Total Ion Chromatography)就是总离子色谱图。经色谱分离流出的组分不断进入质谱,质谱连续扫描进行数据采集,每一次扫描得到一张质谱图,每一张质谱图都对应唯一的一个时间点,将每一张质谱图中所有离子强度相加,得到一个总的离子流强度值,然后以离子强度为纵坐标,时间为横坐标,把各个时间点上的总离子流强度绘制出来,就形成了TIC图。

TIC图长什么样子?大伙儿来感受一下:

3. 蛋白质谱的原理及使用(4)_第13张图片
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为了评估质谱运行状态,李溱老师实验室通常是做一个BSA(牛血清白蛋白)的标准品,进样50-100 fmol(对应几纳克的BSA)。拿到TIC图以后,我们可以先来看色谱峰的强度,峰强度与灵敏度有关。完全清洗并安装好的质谱仪,峰的强度可以达到1E8-1E9,如果我们做完后发现强度只有1E7,则说明质谱的灵敏度有问题(这里需要先排除样品的质量有问题)。如果灵敏度是对的,则说明最基本的参数是没问题的。

对应上面的图,很明显可以看到,同样是自制的trap柱,系统彻底清洗后的峰强度,要大于运行一段时间后的值。

接下来看色谱峰的宽度,峰宽度决定了色谱柱的性能。如果发现峰变得异常的宽,比如下面这样的图,则说明色谱柱,尤其是trap柱的性能明显下降,这时候就需要更换trap柱了。

3. 蛋白质谱的原理及使用(4)_第14张图片
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3. 蛋白质谱的原理及使用(4)_第15张图片
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我们回到第一张TIC图,观察一下会发现,大部分情况下色谱图里都会有一个污染峰(红色圆圈标记)。它是怎么来的呢?这就是我们用的EP管、枪头等带来的污染(就是传说中的塑料峰)。第一个图,由于彻底清洗了系统,所以污染峰是比较弱的,当运行了一段时间后会发现,污染峰又变高了,表示样品中的污染在Trap柱中慢慢地积累。这时候可以用90%乙腈的冲洗液来把柱里的污染物洗掉。

然后,我们再比较一下自制trap柱与商业trap柱的峰宽。第一个图的峰宽,通常在0.5-1分钟,当换成商业化的高端Trap柱(1.7μm粒径填料)时,它的峰宽明显要小很多,可以把峰宽控制在10秒左右。(这两组对比实验我们用的是用的是同一根分析柱。)可见,Trap柱的表现对色谱的性能有很大的影响,当使用比较好的Trap柱时,可以把峰宽控制得很窄。

另外我们需要评估的就是搜库的结果,结果的评分以及每条肽段被检测到的次数,可以反映出二级离子的碎裂效率。如果搜库得到的肽段得分都比较低,则说明二级离子的碎裂效率变差,这时需要考虑清洗色谱柱以及离子源设备等。

特别提示
导致色谱峰变宽的另一种可能,是trap柱严重污染引起的。这种情况下,我们会发现一个很神奇的现象,就是搜库结果的评分并不低,有时候反倒会非常高!这是为什么呢?

我们可以来分析一下。色谱峰变宽,代表着出峰时间变长。比如,原来在10秒-30秒可以出峰完的一个肽段,这时候可能需要2-3分钟来出峰。也就是说,该肽段被检测到的次数会增加好几倍,于是搜库软件也会打出的得分也会变高。而这时候得分变高显然并不代表柱效变高了,反倒是柱效下降了。这是一个很有意思的现象。它提醒我们,当察看搜库结果的评分时,一定要综合地判断,如果出现色谱峰变宽,即便评分很高,也不代表是一个好的结果。

异常峰

有时候,我们还会碰到TIC图出现一些很奇怪的峰。在展示不正常的峰之前,我们先来感受两张正常TIC图的画风。

3. 蛋白质谱的原理及使用(4)_第16张图片
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上面两张TIC图分别对应的是一个复杂样品和一个SDS-PAGE条带的简单样品。复杂样品中,我们可以检测到1000多个蛋白,SDS-PAGE条带对应着几十个蛋白。不同复杂度的样品,谱图的画风也是不一样的,通过谱图,我们对质谱仪工作的状态可以有一个了解。通常针对上千个蛋白,或者几十种蛋白,我们能看到的正常的谱图就是这样。

但有时候,我们会碰到一些很奇怪的TIC图,则可以判断色谱或质谱出了问题。比如下面的例子:

3. 蛋白质谱的原理及使用(4)_第17张图片
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可以看到,第一张TIC图在中间偏右的位置,有一系列连续的有规律的出峰,这种说明样品可能受到了PDMS或PEG聚合物的污染。它的特点就是,在质谱图上可以看到有一系列质量相差44、88或者74的污染峰。它们的来源通常是质量比较差的EP管。比如PDMS就是EP管的脱模剂,在制造的时候会涂在模具上,生产好后如果没有清洗干净,就会随着EP管进入样品。如果看到这样的峰,我们就得检查是不是EP管质量不好,下次应该更换质量更好的EP管。

第二张图是一个比较极端的例子,样品可能受到除PEG或PDMS以外的物质的污染,产生了非常强的污染信号,这种污染对于质谱来说是灾难性的,因为它的含量非常高,该信号强度相当于几微克蛋白对应的质谱信号。而且对于纳升液相色谱,所有的样品都是通过喷针进入到毛细管和质谱仪中的,也就是说,大量的污染也都进入到了毛细管和质谱仪中了,这是非常麻烦的事情,需要停机,做彻底地清洗。所以我们一定要使用质量好的EP管以及来源可靠的试剂。

超载

目前的质谱仪,性能已经非常好了,通常我们进样500ng就可以获得很好的鉴定结果,因此不需要盲目地大量地进样,否则就会造成超载的问题。

3. 蛋白质谱的原理及使用(4)_第18张图片
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比如上面第一张图,是正常的进样量,峰宽40秒左右,下面一张图则是盲目进样导致峰非常宽,超过了5分钟。

大量进样到底会造成什么样的问题呢?最直接的影响就是,容易污染离子源,而且在trap柱中不容易被彻底清洗干净,发生拖尾。也就是说,上一样品在trap柱中的残留会污染下一个进样。要解决这个问题,我们又得把整个实验停下来,非常彻底地清洗trap柱,耽误大量的时间。所以对于现在高性能的质谱仪来说,大家尤其不要盲目地增加进样量,这不但不能提高蛋白的鉴定效率,反而只会增加后续清洗的负担。

质谱信号丢失或不稳定

最后,我们来聊一聊当质谱没有信号了,或者信号不稳定的时候,应该怎么办。通常,查找问题的顺序和逻辑是这样的:

3. 蛋白质谱的原理及使用(4)_第19张图片
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首先我们要看有没有背景信号,就是说会不会得到一个基线噪音。如果没有基线噪音,有可能质谱仪系统,读不出任何数据了。下一步我们需要确认,当没有基线噪音时,有没有东西进入质谱仪,或者有没有东西从质谱仪出来:

1) 确认离子源有没有喷雾电压,如果没有喷雾电压,则说明喷雾停止了,没有东西进入质谱仪。如果有的话,比如喷雾电压设为2.0,而质谱检测到的电压为1.96,且还检测到了电流,说明离子源还在工作,有离子进入质谱仪。

2) 当确认了离子源还在正常工作以后,接下来要排除的是质谱仪数据传输故障,也就是说,质谱仪还在工作,能检测到数据,只是无法传输出来。这时可以检测一下质谱仪背后的连接线是否正常连接,有没有出现断开的情况。

3) 如果离子源和数据传输都正常,则很可能是质谱仪本身发生了故障。

4) 最后需要排除的可能是色谱柱发生了堵塞,或者色谱停泵了,导致液相色谱不再传送样品进质谱。这种时候,即便有喷雾电压,也有可能是质谱仪受空气中的污染而产生的电流。

以上就是没有背景信号的情况下最可能发生故障的地方,我们可以一一排查。

如果有基线噪音,却没有样品的信号,则需要排除以下可能:

1) 放错样品瓶。放进色谱的样品瓶里其实没有样品,或者样品装得太少了,进样针够不着样品。

2) Trap柱失效了。Trap柱是用来Trap蛋白的,正常的操作流程是,先用99%的水把蛋白样品打到Trap柱上去,然后再切换到分析柱上,把蛋白样品从Trap柱上洗下来。如果Trap柱失效了,它不能够Trap蛋白,蛋白样品就会被直接洗到废液中去,这样也会导致没有质谱信号。这种情况下我们需要更换Trap柱试试。

3) Trap柱切换阀的故障。这个切换阀决定了流出来的东西是进分析柱还是进废液,如果阀出现了故障,造成样品进不了分析柱,而是一直都只能进入废液,于是也就没有样品可以进入质谱了。

4) 漏液。如果发生漏液,则进质谱的信号会变弱,这种时候应该检测漏液情况。

如果有信号,但信号不稳定:

1) 系统漏液,导致流速变低,使得信号不稳定。

2) 喷针污染,没法喷出连续的气雾,断断续续的,且会在针尖形成液滴。这种时候质谱信号就会很不稳定。我们可以用甲醇或乙醇溶液把喷针冲洗干净再试试,如果还是解决不了,就需要换个新的喷针;

3) 往喷针上供电的接头插得不牢固,也会导致喷雾不连续。这时可以检查一下接头上是否锈掉了,如果有,把锈磨掉,再插上试试。

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