宫内生长受限的新生仔猪肠道微生物研究

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前言

母猪的繁殖性能直接决定了现代养猪业的生产效率和经济效益，虽然母猪的繁殖性转可以通过营养调控、饲养策略和遗传育种进行提高，但仔猪初生重过下在养殖场仍然广泛存在。宫内生长受限[Intrauterine growth retardation (IUGR)]是指哺乳动物胚胎/胎儿或其器官在怀孕期间生长发育受损，这将严重影响动物健康和生产,例如，动物一般新生儿存活率较低，肠道功能紊乱，营养利用效率低，出生后长期生长受限。哺乳动物的胃肠道中蕴藏着复杂多样的微生物群落，它们在宿主消化、代谢、免疫功能和氧化还原平衡中起着至关重要的作用，新生儿肠道微生物群的早期生活定植和发育高度影响宿主的代谢和健康。微生物定植过程可能受到各种因素的影响，如分娩方式、婴儿时期的饮食组成、抗生素的使用和宿主的健康状况等。猪其大肠和小肠及粪便中的微生物存在一定差异，其中，粪便中的微生物与大肠的较为相似，有证据表明，初生重小的仔猪有着不同的微生物群落结构及代谢物成分，这说明肠道微生物可能对仔猪的生长发育存在一定的影响。然而，IUGR仔猪的小肠微生物组成目前仍不清楚。因为小肠是发挥消化、吸收、代谢和免疫功能的主要场所，小肠内的微生物对宿主有着重大影响，因此本研究中，作者对宫内生长受限新生仔猪和正常初生仔猪（NBW）的小肠微生物进行了差异比较，探究影响生长性能的肠道微生物，确定IUGR仔猪的微生物标记。

试验材料与方法

• 试验动物材料
  本试验选用长大二元杂仔猪作为试验动物，出生体重高于窝平均出生体重的仔猪被归类为正常仔猪，平均出生体重在窝均重10%以下的仔猪被归类为IUGR仔猪，选定了24窝母猪，每一窝挑选一头初生重最大和一头初生重最小的仔猪，共48头仔猪被选定为试验动物。在出生后7d、21d和28d，分别在每个时间点对16头仔猪（8头正常和8头IUGR仔猪）进行称重和宰杀，收集空肠和回肠内容物。
• 方法
  提取粪样DNA；建库测序；生物信息学和统计分析（具体生信分析内容见结果）。

结果

仔猪体重和日增重

从图1a可知，IUGR仔猪出生体重显著低于(39%,P<0.05)正常仔猪。在7d，21d，28d时，IUGR仔猪体重分别低于正常仔猪的36, 27 和 36%，此外，从图1b可知，IUGR仔猪体重日增重分别比正常仔猪低了32, 23 和35%。

图1

小肠微生物群落的多样性

通过α多样性分析发现，在第7d时，IUGR仔猪空肠内微生物的Chao1值显著低于正常仔猪，且21d时，IUGR仔猪空肠内微生物的Shannon指数值也显著低于正常仔猪，而28d时，不管是IUGR仔猪还是正常仔猪的空肠微生物多样性并无显著差异（图2）

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IUGR组和正常组小肠细菌群落结构的差异利用OTU水平进行了PCoA分析，结果没有两个组不同部位的数据均未发生显著分离（图3a）。

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，因此进一步进行了PLS-DA分析，结果发现，不管在7d，21d还是28d，空肠和回肠的微生物群落结构被清楚地分离并聚集成两组，这表明IU GR和正常仔猪小肠微生物区系差异显著（图3b）。

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小肠微生物群落的组成

在门和属分类水平上对所有样本的微生物群落进行了分析，在不同年龄仔猪空肠和回肠中硬壁菌门都是优势门。在空肠中，硬杆菌、变形杆菌和类杆菌门是7d，21d及28dIUGR仔猪的优势门，也是7d和21d正常仔猪的优势门，而正常仔猪在28日龄时，其空肠内放线菌门丰度增加成了优势门，两个组空肠内拟杆菌门和放线菌门丰度都不断增加，两组猪群空肠中蛋白菌门在7和21日龄呈增长趋势，但28日龄下调了，硬壁菌门在两组猪群中随着年龄的增加不断下调，但正常仔猪28日龄出现了增长（图4a）。相似的，在回肠中， 硬杆菌、变形杆菌和类杆菌门是两组猪群的优势门，其中硬壁菌门随着时间增长不断下调，此外，IUGR仔猪的蛋白菌门和正常仔猪的拟杆菌门都随时间而增加，IUGR仔猪的拟杆菌门和正常仔猪的蛋白菌门在7-21天不断增加，但28日龄时出现了下调(图4b)，

图4a,b

在属的水平上，以热图的形式展示了微生物在不同样本中的分布情况（图4c），

图4c

在空肠中，乳杆菌属在不同组和不同时间点都是含量最高的属，在回肠中，在7日龄IUGR和正常组仔猪中均是乳杆菌属为优势属，其后是韦荣球菌属和消化链球菌属，在21日龄时，放线杆菌属，消化链球菌属以及乳酸杆菌属是IUGR仔猪中丰度最高的三个属，消化链球菌属，放线杆菌属以及韦荣球菌属正常仔猪中主要的优势属。在28日龄时，大肠杆菌-志贺氏菌属是IUGR仔猪主要的属，其后是乳酸杆菌属，放线杆菌属。巨球型菌属，乳酸杆菌属和消化链球菌属是正常仔猪丰度最高的三个属。

IUGR和NBW仔猪肠道微生物群落差异

为了鉴定IUGR和NBW仔猪肠道微生物差异，进行了威尔科克森符号秩检验，在门水平上， IUGR组空肠拟杆菌门丰度明显低于NBW组（7，24，28d）（图5a-c），而 IUGR组回肠蛋白菌门丰度明显高于NBW组（21，28d）（图5f，g）。此外， IUGR组21日龄回肠硬壁菌门和28日龄空肠内螺旋体门的相对丰度明显低于NBW组(图5d，e)。

图5

，在属的水平上，与正常组相比，IUGR组空肠中有9个属的丰度较低，包括拟杆菌属，无等级菌科，半球菌属，黄杆菌属。而Sharpea在7日龄IUGR组高于正常组（图6a），在21日龄时，IUGR组的多形杆状菌，纤毛菌属，消化链球菌属，斑虫属，溃疡伯杰氏菌显著低于正常组（图6b）。在28日龄时，在IUGR组中大肠杆菌-志贺氏菌显著高于NBW组，其它78个属显著低于正常组（图6c）。

图6

在7日龄时，IUGR组回肠中4个属丰度（P<005）高于NBW组，包括莫拉克斯氏菌属，罗思氏菌属，毛螺菌科，氨基球菌（图7a），在21日龄，IUGR组4个门的丰度低于正常组，它们分别是芽孢杆菌，Cellulosilyticum，琥珀酸弧菌属，和一种未定义的菌，而热布鲁氏菌在IUGR组的丰度高于正常组（图7b)，在28日龄时，5种属的丰度在IUGR组高于正常组，它们分别是大肠杆菌属、巴氏杆菌属、细毛菌属、未分类的巴氏杆菌科和丹毒丝菌属;三种属在IUGR组低于正常组，它们分别是八叠球菌属，棒状杆菌1号和双歧杆菌（图7c）。

图7

与新生仔猪体重相关的微生物标记

为了解析肠道微生物与仔猪体重的相关性，将微生物丰度与仔猪体重性状进行了spearman关联分析，鉴定了14种微生物与体重正相关，5种微生物与体重负相关（表1）.

表1

小肠微生物功能预测

最后，作者利用PICRUSt对初生仔猪肠道微生物的功能进行了预测，结果如下：7日龄时，与NBW组相比，IUGR组显著富集了6条途径，包括帕金森病、内吞、醚脂代谢、三种下调途径，万古霉素类抗生素的糖鞘脂生物合成（图8a-b）。在21日龄时，与NBW组相比，IUGR组显著富集了10条通路，包括磷酸转移酶系统、细菌毒素、RNA降解、铁磷基团非核糖体肽和孔隙离子通道的生物合成，且27条途径被下调，包括脂多糖生物合成、铁磷基团非核糖体肽生物合成、α-亚麻酸代谢和N-糖基生物合成（图8c-d）,在28日龄时，与NBW组相比，IUGR组富集了8条途径，包括细胞凋亡、酮体合成和降解、上皮细胞和百日咳的细菌侵袭，且糖代谢、蛋白质消化吸收、半乳糖代谢、甘油脂代谢和亚油酸代谢等35条途径被下调（图8e-f）。

图8

小结

本研究通过宫内生长受限仔猪和正常仔猪在出生后不同时间点观察其小肠微生物物的动态变化，对比分析了正常和功能生长受限了微生物差异，找到了系列标志性微生物，同时将微生物与体重关联分析，找到了可能影响仔猪生长的微生物，最后应用功能预测手段，对微生物进行了功能预测。