基因家族分析 | 基因家族成员鉴定(hmm模型＆同源blast)

方法一：基于hmm模型的鉴定方法

1.准备数据
①下载拟南芥基因组fasta文件、注释文件gtf/gff3文件：ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-36/fasta/arabidopsis_thaliana/

Arabidopsis_thaliana.TAIR10.gff3.gz
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.cds.all.fa.gz
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz  

②下载 NBS-ARC基因家族的hmm模型：http://pfam.xfam.org/(下载方法参见 零基础-完全重现某个基因家族分析文章（的分析部分）)

NBS-ARC.hmm    #PF00931

2.目标基因家族搜索与筛选

source /data1/spider/miniconda3/bin/activate
conda activate bioinforspace

#目标基因家族搜索
hmmsearch --cut_tc --domtblout NBS-ABC.out NBS-ARC.hmm Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz

#过滤筛选得到E-value小于1*10-20,先拿到序列号
grep -v "#" NBS-ABC.out|awk '($7 + 0) < 1E-20'|cut -f1 -d  " "|sort -u > NBS-ARC_qua_id.txt
#再根据序列号，从Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz中提取序列
less Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz | /data1/spider/ytbiosoft/seqkit grep -f NBS-ARC_qua_id.txt > NBS-ARC_qua.fa

3.多序列比对，构建目标物种的NB-ARC基因家族的hmm模型

#对筛选出来的序列用clustalw进行多序列比对
/data/shaofeng/clustalw/clustalw
弹出clustalw的操作界面，以下展示具体输入过程：
选择1（输入待比对序列）→ 输入待比对序列的文件名：NBS-ARC_qua.fa → 选择2（开始进行序列比对）→选择9（选择输出比对结构的格式为aligned）→ 按enter键 → 选择1（选择比对模式为全局比对） → 指定输出的比对结果的文件名称:NBS-ARC_qua.aln → 回车后开始比对 → 输入一个树文件名(new GUIDE TREE file):NBS-ARC_qua.dnd （最后才能得到NBS-ARC.aln，否则NBS-ARC.aln为空）

#使用hmmbuild对这些置信的序列进行隐马尔可夫模型的构建，即构建更加准确的hmm模型来尽可能的预测目标物种中NBS-ARC基因家族中所有的成员。
hmmbuild NBS-ARC_qua.hmm  NBS-ARC_qua.aln

hmmsearch --cut_tc --domtblout NBS-ARC.second.out NBS-ARC_qua.hmm Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa

4.利用目标物种的hmm模型再次筛选目标物种中符合要求的序列

#再次对这些基因进行过滤和提取
grep -v "#" NBS-ARC.second.out|awk '($7 + 0) < 1E-03' | cut -f1 -d " "|sort -u >final.NBS.list

less Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz | /data1/spider/ytbiosoft/seqkit grep -f final.NBS.list > final_NBS-ARC_qua.fa

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方法二：基于同源比对blast的鉴定方法

1.下载NCBI 中所有植物存在于Ref-seq中的NBS序列（Ref-seq一般被认为是比较置信的植物基因序列）

①ncbi中总共找到250条存在于植物Ref-seq中的NBS序列

②上一界面下拉至底部，批量拷贝找到的蛋白序列

2.将下载的蛋白序列存放至ref.nbs.plant.fa文本文档中，上传至服务器

3.blastp比对并筛选目标物种中符合要求的序列

#用makeblastdb建立blast数据库
makeblastdb -in ref.nbs.plant.fa -dbtype prot -out blastdb

#用blastp进行序列搜索，得到每个序列的相似序列
blastp -num_threads 20 -db blastdb -query Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa -outfmt 7 -seg yes > blastp.out &

#筛选identity大于75%的序列
cat blastp.out |awk '$3>75' |cut -f1 |sort -u > blastp_result_id.list

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将上述两种方法得到gene id合并取交集，找出两种方法共有的基因家族成员，使结果更可信。

comm -12 blastp_result_id.list final.NBS.list > common.list

less Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz | /data1/spider/ytbiosoft/seqkit grep -f common.list > final_searh_NBS-ARC_qua.fa

通过这幅图可以看到，最后merge在一起的gene id只有4041个

最后，还可以通过一些网上的保守结构域搜索网页，进一步对所找出的结果进行验证，比如：
NCBI CD-Search tool https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi
Pfam的搜索 https://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1
InterProScan sequence search https://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search

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参考：
01 基因家族专题(1)：基础知识与研究思路介绍
02 基因家族专题(2)：数据下载与基因家族成员的鉴定
03 基因家族专题(3)：基因家族成员的鉴定
04 seqkit 使用说明- 知乎