【整理】CRISPR-Cas9用于病毒性传染病防控的最新进展

2 CRISPR-Cas9用于病毒性传染病防控的最新进展

2.1 艾滋病

艾滋病(AIDS)仍然是对人类健康构成主要威胁的流行性疾病.过去30年来医生都在使用抗逆转录病毒疗法治疗人类免疫缺陷病毒(HIV)携带者，但是这种治疗只能防止疾病发展成为AIDS，却不能完全治愈病人.最新的研究表明，HIV促使抗病毒的干扰素信号通路降解，而没有了这些抗病毒分子，免疫系统也就无法清除病毒感染[71].

艾滋病的最终治疗方法是去除和破坏潜伏感染细胞中整合的HIV原病毒或完全消除这些潜伏细胞[72].基因编辑技术的突破展现了消灭HIV的潜力，因为可以通过CRISPR-Cas9在宿主细胞基因组中有效地操纵前病毒.研究者们集中于应用CRISPR-Cas9来删除或破坏HIV受体在人类细胞上的表达.2013年Ebina等[73]首次尝试应用CRISPR-Cas9切割并突变HIV中促进HIV表达的LTR启动子位点以破坏和消除人类细胞中的原病毒.其他研究人员亦报道了类似的研究，其中CRISPR-Cas9靶向病毒LTR或重要病毒基因可以显著抑制CD4+ T细胞衍生的细胞系中HIV-1产生和感染[74-76].HIV治疗的一个新突破是，Liao等[77]使用多重靶向HIV-1基因组的方法来抑制人类细胞中的HIV复制，它比使用单个gRNA更有效，这种方法消除了T细胞衍生系长期培养中的病毒复制并可解决单个gRNA长期使用导致的CRISPR耐受突变的问题[78-79].Wang等[80]发现HIV复制被CRISPR-Cas9抑制不久，由宿主细胞的NHEJ修复机制产生的HIV突变体部分显示出对CRISPR-Cas9的抗性.这可能是由一些对病毒复制无害的片段插入所造成的，靶DNA序列改变后不能被相同的gRNA识别，导致了病毒的逃逸现象[80-81].病毒的逃逸可以通过靶向病毒基因组中的重要片段或者同时指引多个gRNA作用于原病毒来控制[82]，同时CRISPR-Cas9技术在根除AIDs的应用中进行认真的设计和谨慎评估也是十分必要的.该方法的缺点在于HIV原病毒的多重靶向将导致多区域大片段的缺失或插入.随后Lei等[83]发现使用DNA双链作为模板或暂时抑制内源性APOBEC3，可抑制Cas9切割后引起的有害突变.CRISPR-Cas9直接靶向HIV前病毒的基因组可能是未来失活甚至清除感染的个体中潜伏HIV的治疗选择.

许多研究人员还将重点放在应用CRISPR-Cas9技术来破坏HIV受体在人类细胞上的表达.由于CD4是人类T细胞中维持正常的细胞功能必不可少的重要受体，因此CXCR4和CCR5的HIV二级受体往往是CRISPR-Cas9技术用于靶向的候选者[84].如Hu等[85]利用CRISPR-Cas9在人类原代CD4+ T细胞中有效地破坏了CXCR4基因，改造后的T细胞显示出对HIV感染的抵抗力，并且HIV感染早期病毒蛋白p24的表达降低60%.如果用特定的替代序列进行校正T细胞基因，而不是删除，则能提高用于临床治疗的机会.Schumann等[86]利用Cas9核糖核蛋白与同源修复模板以高达约20%的效率替换了原代人类T细胞的CXCR4和PD-1的核苷酸，同时Cas9核糖核蛋白比其他使得细胞长时间暴露于Cas9的传递模式更为安全.CCR5首次引起艾滋病研究人员的注意是在2007年，一位名叫Timothy Brown的HIV阳性患者通过骨髓移植而被治愈.后来科学家发现他的骨髓供者含有CCR5突变，使他的细胞对HIV感染产生了抵抗力.2009年，Hütter等[87]将带有CCR5Δ32纯合子供体的造血干细胞移植到一名患者体内，移植后20个月患者没有病毒反弹并停止抗逆转录病毒治疗.这一发现促进更多研究者开发基于移植的干细胞或T细胞疗法用于治疗HIV感染.Ye等[88]利用CRISPR-Cas9在诱导多能干细胞(iPSCs)引入CCR5Δ32突变，随后分化而成的单核和巨噬细胞表现出对HIV的抗性.这种方法比TALENs更有效，单个等位基因的同源重组效率接近100%.随后，几个研究小组报道了靶向CCR5的CRISPR- Cas9用于保护造血祖细胞，CD4+ T细胞系和原代CD4+ T细胞免受HIV感染[89-93].同时靶向两种HIV共同受体以产生病毒抗性的可移植细胞有望用于临床治疗HIV感染.

开发利用CRISPRa诱导HIV-1的重新活化继而通过宿主的细胞病变或免疫监视机制来消灭病毒是一种新兴的方法[94-95].CRISPRa通过融合催化失活的dCas9蛋白和转录激活因子结构域来特异性地激活潜伏HIV病毒的复制和转录，并且无遗传毒性[96-98].dCas9-VPR、协同激活调节物(SAM)和dCas9-Suntag转录激活系统通过sgRNA证明了它们在体外功能遗传学研究中是有效的，但是由于体内Cas9融合蛋白转染效率偏低且编码dCas9/ gRNA与共转录激活物复合物的序列超出了最常见的病毒载体的容积，它们被应用于体内研究仍然是个挑战.Liao等[99]利用基因改造带有两个用来招募MPH转录激活复合体的dgRNA系统，在小鼠体内高水平地激活由于衰老或机体损伤而沉默的内源性基因的表达来恢复小鼠正常的生理功能.这种新型的基于表观遗传重塑的系统在体内激活潜伏HIV的研究和是否会引起宿主的免疫应答仍然有待于验证.此外，CRISPRa可以上调抗病毒限制因子来增强人类细胞内源性抗病毒防御.Bogerd等[100]使用这种方法在人类CD4+T细胞上调了抗病毒效应物APOBEC3B (A3B)和APOBEC3G (A3G)，诱导激活的A3B和A3G表现出抑制野生型HIV-1感染性.SAMHD1、TETHERIN、TRIM5α等最近发现的抵抗HIV的关键蛋白质在体内的特异性激活将成为抑制HIV病毒入侵的重要策略[101-103].Park等[104]使用CRISPR-Cas9全基因组筛选发现CD166抗原(ALCAM)、蛋白酪氨酸磺基转移酶2(TPST2)和腺苷3′-磷酸5′-磷酸硫酸转运蛋白1(SLC35B2)对HIV病毒复制十分关键，并且这些基因的敲除并不影响细胞活力.随后，这些新发现的宿主依赖性因子在生理相关的原代CD4+ T细胞中被证明在介导HIV感染方面的重要性.总之，CRISPR-Cas9技术在根除HIV方面展现很大的潜力，未来CRISPR-Cas9技术用于艾滋病治疗的研究将以安全性、效率和特异性为重点.FDA已经批准在几项临床试验中使用CRISPR-Cas9技术，我们相信在不久之后CRISPR-Cas9能够登上临床治疗和预防HIV的舞台.

2.2 乙肝病毒

目前世界上约有2.4亿乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性携带者.HBV慢性感染增加致死性并发症(包括肝硬化和肝细胞癌)的风险，每年导致约60万人死亡[105]. HBV病毒体含有部分双链DNA基因组，其在感染后不久在核内转化为双链共价闭合环状(ccc)DNA.在HBV复制期间持续存在的稳定的cccDNA是病毒RNA转录的基因组模板，包括病毒蛋白的前基因组RNA(pgRNA)和信使RNA(mRNA)，因此消除或永久灭活cccDNA对于根除慢性HBV感染至关重要[106-107].针对HBV的批准疗法如基于干扰素α(IFN-α)的免疫调节剂和逆转录酶(RT)抑制剂带有严重的副作用并且很快由于病毒抗性的出现而变得无效[108].包含HBV表面抗原的疫苗已被纳入许多国家的免疫治疗规划中.疫苗可以有效预防HBV感染，但对现有HBV携带者却没有治疗作用[109].

基因组编辑技术是特异性破坏HBV基因组的有效方法，其中CRISPR-Cas9因其设计gRNA的简便和灵活并适用于靶向任何目标基因使得消灭cccDNA成为可能.Lin等[110]第一次使用CRISPR-Cas9来限制HBV的感染，他们分别将HBV表达载体转染入人肝癌细胞和HBV持久型的小鼠模型，发现在体外和体内实验中HBV基因组模板都可以被有效地破坏.随后的一些研究通过使用HBV-表达质粒共转染模型、HBV感染的细胞系、HBV-表达质粒的水动力注射(HDI)模型或HBV-转基因(HBV-Tg)小鼠模型，证明了CRISPR- Cas9在体内外可以有效地破坏HBV基因组，甚至是cccDNA[111-123].具有多个gRNA的CRISPR-Cas9系统可以同时切割HBV基因组的多个位点，从而提高HBV基因组失活的效率[110, 116-117, 120].几项研究还表明CRISPR-Cas9系统可以破坏或灭活HBV的cccDNAs和整合的HBV基因组[111-114, 116, 119, 123].随后，Seeger等[124]利用二代测序确定了Cas9切割和经过非同源末端连接(NHEJ)修复的cccDNA中完整的突变谱.结果表明CRISPR-Cas9系统是迄今为止功能性地灭活HBV cccDNA的最佳方法，并为慢性乙型肝炎的治疗提供更好的策略.

目前针对HBV的脱靶效应来说，只有少数研究报道，通过基因组编辑检测实验或潜在脱靶位点的测序来检查HBV特异性gRNA的脱靶效应[116, 120, 123].二代测序比基因组切割检测试验对脱靶效应更敏感.有研究表明，利用Cas9切口酶可以提高对HBV基因组编辑的特异性，并且有较高的针对HBV的抑制效率[114, 120].具有更短的原型间隔子互补区的截短型gRNA和高保真度的Cas9内切核酸酶都有待于研究降低抗HBV治疗的脱靶效应.尽管如此，开发一个CRISPR-Cas9脱靶效应长期风险评估的平台还是非常必要的.

最近，Wang等[125]将CRISPR-Cas9与RNAi结合起来，发现其可以在体外和体内发挥协同作用来抑制HBV复制.更重要的是，这种鸡尾酒疗法显示出对cccDNA强效的破坏作用[125].gRNA-miRNA-gRNA三元盒具有广泛用于基因组编辑的研究和治疗应用的潜力，尤其是抗病毒治疗.来自化脓链球菌(Sp)的Cas9蛋白较大，这使得利用AAV载体将CRISPR-Cas9系统有效递送至肝或肝细胞仍然是个难题.Liu等[126]通过使用更小的葡萄球菌(sa)的Cas9很好地解决了这个困扰，这个系统也许会代替传统的SpCas9成为对抗慢性HBV感染的新型治疗手段.已有研究者通过检索HBV序列数据库以找到HBV基因组的保守区域，靶向HBV基因组保守区的CRISPR-Cas9系统也许会对不同基因型的HBV具有更广泛的抗病毒活性[127].总之，CRISPR-Cas9系统能够特异且有效地破坏HBV基因组并且没有明显的细胞毒性.遗憾的是这些人造模型并不能完全模拟类似于cccDNA大量存在于肝细胞中的持续性HBV感染.这些研究通过使用cccDNA特异性引物进行PCR来定量cccDNA.但已有研究表明，这种基于PCR的cccDNA测定也许并不能准确地测量cccDNA水平[128].因此，开发具有可定量cccDNA的体外检测系统对于监测CRISPR-Cas9的抗HBV功效是十分重要的.并且，CRISPR-Cas9在清除慢性HBV感染cccDNA的作用还需要在临床上进行证实.

2.3 疱疹病毒

疱疹病毒是一类具有包膜的双链DNA病毒，一旦进入细胞核，病毒DNA会被环化并保持为游离基因[129].它们可以感染宿主并建立终身潜伏感染.在潜伏期中，病毒蛋白质的表达受到抑制，从而逃避宿主免疫系统的检测[130].世界卫生组织预估超过90%的成年人至少感染8种疱疹病毒中的一种，目前对疱疹病毒感染的治疗主要是通过使用阻断病毒复制的核苷类似物[131].但是这些药物在感染的潜伏期无法发挥作用[132].另外，疱疹病毒可能对常用的核苷类似物产生抗性，例如阿昔洛韦和更昔洛韦[133].开发可替代的策略来提供对抗疱疹病毒感染的保护或清除感染的宿主细胞中的潜伏病毒变得迫在眉睫.

最近已有很多研究报道了CRISPR-Cas9基因编辑系统在体外细胞培养中抗疱疹病毒的应用，包括单纯疱疹病毒1和2(herpes simplex virus, HSV-1/2)、巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)和EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)[134-159].HSV-1经常感染口腔黏膜上皮，而HSV-2经常感染生殖器黏膜.随后，HSV-1病毒进入感觉神经元的轴突并通过逆行转运迁移到以三叉神经节(TG)为主的细胞，而HSV-2则是迁移到骶骨背侧神经节的细胞体中，从此建立了一种潜伏性终身感染[134].2014年Bi等[135]首次利用CRISPR-Cas9系统在野生型HSV-1病毒引入位点特异性突变和外源基因，原病毒的复制过程被特异性抑制，子代病毒中重组病毒的丰度也显著增加.体外构建HSV基因组模型通常依赖于低效率的自发性同源重组和费时费力的细菌人工染色体技术[136-137].研究证实了使用CRISPR-Cas9系统制造突变型HSV-1病毒的潜力，它比传统方法更容易地对用于病毒载体和裂解肿瘤细胞等治疗应用的病毒进行工程化改造[138-140].最近的两项研究展示了抗HSV-1 gRNA在抑制人类细胞系中病毒复制的效力[141-142].在人类上皮和成纤维细胞中引入靶向必要HSV-1基因的CRISPR-Cas9系统可以有效地抑制HSV-1复制.然而，由于CRISPR-Cas9诱导的靶位点的突变使得细胞经长时间孵育后出现逃避Cas9靶向的逃逸突变体.Van Diemen等[141]随后通过共同递送两种gRNA来同时靶向两种重要的病毒基因UL29和UL8.Roehm等[142]同样使用这种方法同时靶向病毒关键基因ICP0和ICP4，在两种情况下观察到病毒的感染几乎被完全抑制.由于HSV以与潜伏感染的神经节中的病毒载量成比例的速率重新激活，即使潜伏基因组不完全失活也可以显著降低疾病严重程度和病毒脱落，甚至导致功能性治愈[143].然而，Van Diemen[141]的实验结果显示，CRISPR-Cas9系统并不能靶向MRC5细胞中的潜伏HSV-1基因组，这可能与HSV-1基因组在核小体存在下呈严重抑制状态有关[144].这种观点同样由Horlbeck[146]和Chen[145]的团队加以证实，Horlbeck团队还发现在体外添加染色质重塑酶可以使Cas9重新恢复活性.因此，使用CRISPR-Cas9来靶向潜伏的HSV基因组将成为突变或清除潜伏细胞中病毒有前景的策略.当然需要更多的研究去评估是否Cas9可以有效切割核小体比率偏低的HSV基因组和染色质重构后的基因组位点，从而有利于治疗角膜或生殖器疱疹的复发性感染.HSV衣壳蛋白不仅保护病毒基因组免受损害，而且在病毒基因组释放到宿主细胞核中发挥重要作用[147].最近，中国科学院生物物理研究所和加州大学的研究者们解析出疱疹病毒HSV-1/ HSV-2衣壳蛋白三维结构，提出衣壳蛋白组装和稳定性的机理，这将为基于CRISPR-Cas9的HSV基因治疗提供新的思路和方法[148-149].

HCMV可以在多种类型的细胞进行复制，包括上皮细胞、内皮细胞、骨髓细胞、神经元细胞和成纤维细胞.HCMV感染是先天性疾病的最常见病，并且该病毒在免疫系统受损的宿主如移植受体中伺机产生感染[141, 150-151].Bierle等[151]通过瞬时转染将单个病毒特异性gRNA靶向豚鼠巨细胞病毒(GPCMV)基因组的GP133位点，发现CRISPR- Cas9可以在预测的Cas9切割位点处产生短的插入或缺失突变.此外，两种gRNA的共转染可以产生大片段的基因敲除，并且可以使用同源重组修复在病毒基因组中引入特定的基因片段.Bierle等的研究第一次证实CRISPR-Cas9技术可以有效地改造GPCMV基因组.Van Diemen等[141]发现单一抗HCMV gRNA可以有效地减弱MRC5细胞中的HCMV感染，病毒复制被抑制.然而，在长时间培养感染细胞后，病毒的靶位点通过缺失完整的密码子(3-6-9-12 bp等的变化)来保持基因的阅读框，从而保留了目标蛋白质的部分功能性，这导致了抗性病毒大量出现.和HSV病毒类似，研究者使用几种gRNA同时靶向病毒的多个位点可以有效防止抗性病毒突变体的出现.然而和HSV病毒有所差异的是，靶向非必需基因US6、US7和US11并不影响病毒复制.这种结果可能是由HCMV和HSV复制动力学差异引起的，HCMV是一种缓慢复制的病毒，DNA修复机器有足够的时间来完全修复断裂的病毒基因组.由于HCMV突变体的体外复制不受非必需基因突变的影响，所以病毒可以像野生型病毒那样有效地复制.CRISPR-Cas9靶向HCMV基因组脱靶效应的评估和靶向潜伏基因组的可行性还有待于进一步研究.

EB病毒(EBV)可以在90%以上的成年人中建立终生感染.EBV主要感染B淋巴细胞和上皮细胞，病毒主要在记忆B细胞中潜伏[152].该病毒引起传染性单核细胞增多症，并与广泛的恶性肿瘤相关，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤和鼻咽癌[153].一些研究已经证实CRISPR-Cas9技术可以有效编辑EBV基因组和干扰EBV复制[141, 154-156].Wang等[154]首次将CRISPR-Cas9系统应用于潜伏性疾病感染治疗即特异性靶向潜伏EBV感染的基因组.gRNA被设计为靶向潜伏EBV基因组上的多个位点，包括病毒基因EBNA1、EBNA3C和LMP1.通过结合7种gRNA并将它们转染到潜伏的淋巴瘤细胞中，EBV病毒DNA在活细胞和死细胞分别减少65%和85%.Van Diemen等[141]则靶向了EBNA1和EBV的复制起点区域的几个区域，并发现单个gRNA靶向重要的EBNA1基因导致细胞潜伏的EBV损失50%~60%，导入靶向EBNA1基因上不同区域的第二个gRNA导致EBV基因组的去除率达到95%.因此，多种抗EBV gRNA同时施用于潜伏感染的细胞将进一步增强EBV游离基因的不稳定性并可能有助于完全根除病毒.在潜伏期中，病毒不会产生病毒后代却会产生大量的非编码RNA例如miRNA.这些miRNA会靶向病毒基因以逃避免疫应答和调节病毒基因表达并诱导癌变，因此靶向激活miRNA表达的启动子区域是对抗病毒的新策略[157-158].Yuen等[155]使用CRISPR- Cas9特异性地在编码病毒miRNA的BART启动子P1和P2区域中引入558 bp的缺失突变并通过同源重组在同样的位点引入一个选择性标记物，在潜伏性感染EBV的几种人类上皮细胞系中都证实这种方法是有效的，并且首次证明P1和P2是BART RNA转录的主要启动子.Van Diemen等[141]在潜伏感染的胃癌细胞系中用CRISPR-Cas9同样靶向了病毒miRNA的BART5、BART6和BART16，测序结果显示CRISPR-Cas9具有很好的位点特异性.通过删除其启动子来消除miRNA表达和活性的策略还可以被推广并用于其他生物系统中.CRISPR-Cas9还可以应用于构建重组EBV病毒，如Kanda等[156]通过同源重组修复高效地将BAC载体序列插入到EBV基因组内的特定基因座，并通过使用重构病毒感染上皮细胞来研究EBV介导的上皮癌发生机制.显然，对更多的疾病相关病毒基因组进行测序以及对这些病毒进行重构和实验测试以确定它们与非致病性病毒的行为是否不同是很重要的.在早期的类淋巴母细胞系(LCL)研究中，CRISPR-Cas9的基因敲除技术被用来验证EBNA3相关泛素特异性蛋白酶46(USP46)，在细胞生长中和EBV激活的线性泛素装配复合体亚基HOIP在LCL生长和存活中的宿主依赖性[159-160].最近，CRISPR-Cas9被用于研究CD63在潜伏膜蛋白1(LMP1)外泌体包装中的作用、Ephrin受体A2在EBV进入上皮细胞中的作用以及IL-1受体相关激酶4(IRAK4)或B细胞淋巴瘤6(BCL6)，在抑制裂解性复制的作用[161-164].为了系统地确定对LCL生长和存活重要的宿主依赖因子，Ma等[165]进行CRISPR-Cas9功能缺失筛选并系统地鉴定出57个对EBV感染的淋巴母细胞和87个对伯基特淋巴瘤B细胞生长和存活至关重要的宿主依赖性因子.Ma团队所建立的CRISPR和RNA测序的数据集为未来EBV -宿主相互作用和淋巴瘤发生机理的研究提供了资源，并强调了基于CRISPR-Cas9的筛选在人类肿瘤病毒研究中的作用.另外，在原发性人源B细胞感染早期测试已筛选的宿主依赖因子，如何影响EBV驱动转化细胞的生长和存活是个很有趣的问题.

2.4 人乳头瘤病毒

在没有免疫接种的情况下，人们在其生命中的某个阶段会不可避免地感染乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)[166].HPV是一种双链DNA病毒，感染皮肤或黏膜上皮细胞、生殖器组织和上呼吸道.将病毒DNA整合入宿主基因组后，HPV可导致宫颈癌和口咽或生殖道癌症[167-169].HPV相关的肿瘤发生主要归因于HPV E6和E7蛋白，其对于恶性转化和维持宫颈癌的恶性表型是必需的[170-172].根据几项流行病学和生物学研究，HPV感染是促进宫颈癌发展的主要病因，HPV DNA可以在95%以上的宫颈癌和上皮内瘤样活检中被检测到[173-174].由于HPV癌基因的表达与宫颈癌癌变之间有着密切的关系，靶向这些癌基因新方法的开发可为宫颈癌提供新的疗法.例如HPV疫苗、靶向E6癌基因的肽适体、siRNA和利用HSP90和GRP78抑制剂来抑制E6和E7的几种治疗策略都显示对宫颈癌细胞生长具有抑制作用[175-178].

最近，高效且高特异性的CRISPR-Cas9技术已被开发为一种新型治疗HPV感染的策略并已进入临床试验阶段[179-183].Kennedy等[179]发现在培养HPV-18和HPV-16转化的细胞中，CRISPR-Cas9可以特异性地在E6和E7基因中引入缺失和插入突变，从而抑制p53或Rb的降解，导致肿瘤细胞周期停滞和细胞凋亡.Zhen等[180]将CRISPR-Cas9系统转染入宫颈HPV-16阳性细胞系并靶向E6/E7启动子和E6/E7癌基因，发现p53和p21的积累，宫颈癌细胞体外增殖能力显著降低.随后的两项研究同样表明特异性靶向HPV E6/E7癌基因的CRISPR-Cas9可以有效、特异和稳定地抑制人类宫颈癌细胞的生长[181-182].Liu等[183]破坏人类角质细胞系中HPV6 / 11的E7基因并且也都获得了相似的结果，结果表明CRISPR-Cas9系统具有对生殖器疣进行辅助治疗的潜力.CRISPR-Cas9被证实在体内同样是有效的治疗和消除HPV诱导的癌症的工具.Zhen等[184]将CRISPR-Cas9靶向E6/E7后的皮下细胞接种到免疫缺陷小鼠体内建立移植的肿瘤动物模型，发现小鼠体内肿瘤生长受到显著抑制.Zhen团队随后发现CRISPR-Cas9是用于宫颈癌治疗的顺铂(CDDP)潜在的化学增敏剂.在体内研究发现，CRISPR-Cas9和CDDP的鸡尾酒疗法在诱导凋亡和转移抑制方面优于单一方法治疗.因此，靶向E6 / E7的CRISPR-Cas9与细胞毒性剂的组合可能对P53和Rb功能的恢复具有协同作用，可能是用于治疗宫颈癌的更有效的治疗方式.此外，验证脱靶效应和最小干扰素诱导的评估是基于CRISPR-Cas9的组合疗法临床应用的重要条件.

CRISPR-Cas9不仅可以介导E6和E7的突变来抑制体内外的肿瘤生长，还可以通过基因敲除的手段来发现治疗HPV感染潜在的靶点[185-188].Langsfeld等[189]使用shRNA敲除宫颈角质细胞的SIRT1基因减弱了HPV31基因组的保持并阻断了细胞分化后的病毒扩增.结果证实了SIRT1对于HPV病毒生命周期的保持是必需的.Das等[185]使用CRISPR-Cas9在宫颈癌C33a细胞中准确敲除了SIRT1基因，发现SIRT1的缺失影响了HPV16 E1-E2介导的DNA复制，证明了SIRT1通过调控病毒蛋白的乙酰化状态来调节C33a细胞中E1和E2的DNA复制特性.SIRT1调控HPV转录和复制机理的提出促进了CRISPR-Cas9靶向SIRT1来减弱HPV感染和相关疾病的可行性研究.最近，Leung[186]和Chiang团队[187]同样使用CRISPR-Cas9基因敲除技术分别发现HPV E6蛋白通过富集带有CD55受体的宫颈癌细胞来促进癌细胞的抗辐射性与侵袭性；通过靶向USP15和TRIM25来抑制RIG-I介导的抗病毒的天然免疫信号.CRISPR-Cas9介导的基因敲除揭示了HPV E6蛋白在宫颈癌发生过程中的关键作用，并有望发现新的抑制HPV E6蛋白通路的靶点.已有研究报道整合到HeLa基因组中的HPV片段可以顺式激活位于整合位点下游500 kb的原癌基因MYC的表达[188].Shen等[190]结合染色体构象捕获和CRISPR-Cas9基因敲除技术第一次展示出整合的HPV片段与MYC基因和8q24.22区域的长距离相互作用，整合的HPV片段对于这种作用的保持起主导作用.这种病毒整合对宿主细胞基因和细胞恶性转化的新调控机制未来将成为与病毒感染相关的肿瘤领域的新研究方向.最近已有研究者使用CRISPR-Cas9干扰HPV阴性的头颈部鳞状细胞癌的NSD1来增加化学治疗的效果，这种技术应用在更广泛的HPV相关疾病如生殖器和头颈部鳞状细胞癌将是未来的研究方向[191].

2.5 其他病毒性传染病

人类神经多瘤病毒(JCV)是携带环状双链DNA基因组的无包膜病毒，病毒基因组在细胞核内形成一个微型染色质[192].JCV是一种罕见的脱髓鞘疾病：进行性多灶性白质脑病(PML)的致病因子，并且可能和多种人类肿瘤的发生发展有关[193].PML的多种治疗方案已应用于临床，但是大多都没有成功[194].两项研究报道人类细胞系中的JCV基因组对CRISPR-Cas9介导的切割十分敏感，表明这种技术在抗PML方面的潜在治疗价值[195-196].Wollebo团队[195]使用CRISPR-Cas9靶向病毒复制必需的病毒T抗原的N端区域相对应的DNA序列，通过引入突变干扰病毒蛋白的表达和功能，并且没有出现脱靶效应.然而在这个研究中，在引入病毒基因组之前，CRISPR-Cas9与特定的gRNA已经存在于细胞中，因此可能在DNA复制开始之前就靶向病毒基因组.Chou团队[196]进一步证实在病毒感染后引入CRISPR-Cas9仍然可以特异性靶向JCV基因组的非编码区和基因开放阅读框，成功地抑制了JCV的复制和传播.CRISPR-Cas9为由JCV病毒引起的中枢神经系统的致命性脱髓鞘疾病提供了新的治疗策略.

基于CRISPR-Cas9的全基因组筛选已成功鉴定出对RNA病毒侵入、复制和传播至关重要的宿主因子.许多病毒如脊髓灰质炎病毒或DENV可以裂解细胞，这使得能够在基于细胞活力的筛选中直接选择抗病毒细胞.这种选择获得不支持病毒进入、病毒基因组翻译、病毒基因组复制或病毒诱导的细胞死亡的突变细胞，但通常不包括不支持病毒体组装的突变细胞.在筛选过程中，由于要求抗性细胞在多轮感染后仍要存活，选择会非常严格.因此，这种筛选方法可以鉴定出引起明显表型变化的基因.最近，研究者利用这种筛选方法发现了登革病毒、西尼罗病毒、寨卡病毒和丙型肝炎病毒这4种黄病毒复制所需的内质网(endoplasmic reticulum，ER)相关蛋白质[33-35, 196-198].许多ER蛋白质参与膜和分泌蛋白的生物合成并在N-连接糖基化，ERAD和信号肽插入和加工中发挥重要作用.值得注意的是，这些蛋白质的鉴定结果在不同实验室以及使用不同的细胞系和不同的病毒株都具有显著的重现性.CRISPR-Cas9筛选与单倍体遗传筛选的结果也有很大的重叠，并进一步增加CRISPR-Cas9筛选结果的可信度.

Orchard和Haga团队[30-31]使用CRISPR-Cas9全基因组筛选发现一种诺如病毒的蛋白质细胞受体，CD300lf.CD300lf的表达赋予人类细胞对诺如病毒的易感性，而敲除了CD300lf的小鼠可以抵抗诺如病毒的感染.最新的研究也证实诺如病毒感染一种罕见类型的、表达CD300lf表面受体、被称作簇细胞的肠道上皮细胞，IL-4和IL-25可以促进簇细胞的增殖进而增加小鼠体内受感染的风险[199].同样，CRISPR-Cas9筛选发现了对人鼻病毒(HRV)感染起关键作用的宿主因子，细胞内黏附分子1(ICAM1)和Exocyst靶向与囊泡运输途径组分(EXOC4).ICAM1是已知的HRV受体，EXOC4在参与HRV感染中的作用仍有待进一步研究[197].CRISPR-Cas9技术使我们可以更好地理解RNA病毒生命周期并挖掘抗病毒治疗的潜在靶点，CRISPR-Cas9系统可以与其他技术相结合，开发出更精细的筛选方法.来自弗朗西斯氏菌属(FnCas9)的Cas9(FnCas9)被发现能够有效靶向并切割真核细胞内的HCV病毒，FnCas9可靶向RNA的反义和正义链并通过阻断病毒翻译和复制机制来抑制病毒的繁殖[200].所以，FnCas9很可能用于靶向多种RNA病毒，包括存在ssRNA的病毒(如黄病毒、脊髓灰质炎病毒和鼻病毒)和不存在ssRNA的病毒(如丝状病毒、副黏病毒和正黏病毒).

3 展望

尽管科学家在细菌适应性免疫防御方面进行了一个多世纪的研究，Sapranauskas等在2011年才被发现并鉴定，CRISPR-Cas9系统可以通过在不同的种属间转移来对抗入侵的核苷酸[201].其对推进生命科学在医疗领域的发展有着广泛而深远的影响.本文所概述的研究显示CRISPR-Cas9具有破坏和消除来自人细胞的病毒基因组的潜力(图 2).CRISPR-Cas9在对抗传染疾病方面能提供更持久更特异的效果，有望帮助我们控制和根除一些全球性传染病.CRISPR-Cas9介导的基因编辑使细胞易受小分子抑制剂如化疗药物的影响，这种协同作用可以增强药物的治疗效果，降低用量来减轻毒副作用，还能够验证潜在的药物靶标.然而，CRISPR-Cas9诱导的编辑可能会诱导病毒的逃逸导致产生更多致病性病毒株.研究者通过同时在多个位点靶向病毒基因组来限制这种逃逸病毒的形成，此外，在编码关键氨基酸残基的位点处靶向必需基因也许可以降低逃逸突变体的可能性，因为在这些位点处的大多数编辑将使必需蛋白质失活.使用可替代的效应核酸酶，如更小尺寸、更简单、且高度特异性的Cpf1也许会减少病毒逃逸现象的发生，因为被编辑后的等位基因仍然保持对Cpf1的可靶向性.CRISPR-Cas9似乎是与病毒作斗争的双刃剑，针对宿主而非病毒本身的基因编辑可能是未来成功的关键.

Fig. 2 Strategies to combat virus infections in human cells using CRISPR-Cas9 at present and in future图 2 CRISPR-Cas9系统在当前以及未来预测的用于人类细胞抗病毒感染的策略当前阶段针对人类细胞抗病毒感染的策略分为4个方向：a.通过CRISPR-Cas9直接靶向病毒基因组可应用于在感染周期中带有dsDNA中间产物的病毒，包括综述里提到的所有病毒.单一靶向病毒基因组可能破坏必需的病毒基因或对于病毒复制或维持所必需的基因组；多重靶向病毒基因组可导致多种病毒基因的破坏或病毒基因组的分裂并且有效地防止了病毒逃逸的发生.b.某些病毒如HPV和HIV可将其基因组的一部分整合到宿主的基因组中.通过CRISPR-Cas9靶向病毒侧翼区域，可以从感染细胞中完全切除整合的病毒基因组.或者，可将CRISPR-Cas9导向整合病毒基因组内的重要位点，作为灭活病毒的手段.c.通过破坏病毒感染必需的宿主因子，可以产生抗病毒感染的细胞群.d.通过CRISPRa诱导潜伏(整合)病毒基因组的激活可以诱导潜伏病毒蛋白表达或病毒颗粒产生，继而通过宿主的细胞病变或免疫监视机制来消灭病毒.未来针对人类细胞抗病毒感染的策略主要有：a.通过CRISPRi或CRISPRa筛选异常表达对病毒适应性和宿主细胞的侵入有显著影响的宿主基因，挖掘新的抗病毒靶点.b.使用Cas9核糖核蛋白组装的非病毒载体，抗CRISPR蛋白和人工进化改造的特异性更强的Cas9来显著降低脱靶效应发生的概率.c.无需双链断裂和特异性更强更准确的单碱基编辑有望成为抗病毒治疗的新方向.

图选项

对于临床适用性问题，它是每一项医学进步必须经历的一大挑战，同样地CRISPR-Cas9技术也面临着临床安全和有效性问题.将CRISPR-Cas9递送到人体组织或靶细胞是其治疗传染疾病的一大挑战，因此高效的递送系统对CRISPR-Cas9在临床应用能否成功至关重要.感染细胞的位置和类型可显著影响递送系统的选择，并因此影响疗效.循环细胞中发生的病毒感染的治疗是很困难的，因为这需要有效和全身性地将抗病毒CRISPR-Cas9递送至身体中的大多数器官.同时，这种全身性的递送方法会增加存在于健康组织中的脱靶编辑的风险.在特定组织位点复制的病毒可能更适合于CRISPR-Cas9的靶向，并且CRISPR-Cas9的局部施用降低了旁组织中脱靶编辑的可能性，因此更加安全.AAV载体相比于慢病毒和腺病毒载体来说，具有低的免疫原性和广泛的组织导向性，并且不整合到宿主基因组中，通常被认为可以安全用于体内[202].然而，AAV载体的小包装容量适用于常用的Cas9(SpCas9)或较小的直系同源物，如新发现的Cpf1[203]，AAV载体无法应用于分子质量大的Cas9的包装，并且不太适合于靶向低感染率的淋巴细胞.最近Chew等[204]报道Cas9蛋白可以作为分裂蛋白递送到体内，但是需要两种病毒载体的同时感染.来源于金黄色葡萄球菌(3.2 kb)、奈氏脑膜炎双球菌(3.2 kb)和嗜热链球菌(3.4 kb)的Cas9被报道均可以有效地包装在病毒递送载体中，并且仍保持高效的基因编辑功能[205-207].大部分人群对AAV具有先天免疫力，使得他们不适用于AAV的疗法[208].此外，由于Cas9的持续表达，基于AAV的Cas9递送可能会导致显著的脱靶基因组损伤[86].最后，虽然几个基于AAV的Cas9在体内临床前实验的结果令人兴奋，但是产生治疗水平的基因编辑所需的病毒滴度比临床上可接受的水平高出多个数量级[209-211].非病毒递送系统如流体动力学注射(HDI)、与电穿孔结合的视网膜下注射、基于脂质的阳离子核酸转染、生物可降解的脂质纳米颗粒、脂质体、DNA纳米螺旋可以有效避开病毒递送系统的问题，并且具有良好的膜通透性、高效和更低的脱靶效应[118, 212-216].Doudna团队开发了Cas9核糖核蛋白(RNP)，这种组装的功能性酶同样可以降低脱靶的风险，同时实现在特定组织器官释放CRISPR-Cas9系统，发挥其相应作用[217].脂质体和聚乙烯亚胺是最成功的Cas9 RNP递送载体，并且已经能够将Cas9 RNP递送到耳和肿瘤中以通过非同源末端连接敲除基因.最新报道的CRISPR-Gold纳米颗粒递送Cas9 RNP和供体DNA可以在体内诱导同源重组[218].开发体内诱导的递送Cas9 RNP的非病毒载体将是基因编辑治疗领域中的重要课题.

CRISPR-Cas9在抗病毒方面的大部分研究是基于体外的细胞培养系统，在体内检测CRISPR-Cas9的抗病毒效果有待于更多验证.为了将CRISPR-Cas9这一基因编辑工具发展到临床应用，必须提高其安全性和有效性，即考虑潜在的脱靶效应.研究者们通过改造具有不同PAM偏好或增强目标序列识别的Cas9核酸酶，可以显著降低Cas9切割的脱靶事件，例如成对的Cas9缺口酶、截短的具有较短原型间隔区互补区的gRNA和高精度Cas9内切核酸酶如特异性增强的eSpCas9(1.1)、SpCas9- HF1和HypaCas9[65, 219].连续的人工定向进化方法可以改造生物分子获得期望的性能，近期David Liu团队[220]在细菌中使用基于噬菌体的人工进化系统(PACE)筛选出拥有最广泛PAM兼容性和高特异性的Cas9、xCas9.XCas9的识别能力比SpCas9增加了至少4倍，可以靶向人类基因组中1/4的位点，同时也会扩宽用于靶向病毒基因组和基因组筛选的范围.Casini等[221]则在酵母中通过在REC3结构域制造随机突变并构建突变体库筛选出最优突变体，evoCas9，它突出的优点是超高的保真度，比野生型SpCas9的保真度提高了79倍. CRISPR/ Cas9系统利用天然的gRNA分子进行切割是非常准确的，仅发生大约1%的差错.然而，鉴于人体内有数万亿个细胞，即使发生1%差错也是非常显著的，特别考虑到基因编辑是永久性的.若发生错误切割，那么患者可能最终会患上如癌症之类的严重疾病.近期，一种被称作桥接核酸(bridged nucleic acid，BNA)的合成向导分子替换天然的向导RNA(gRNA)分子可极大地提高基因编辑技术的准确性，将它的特异性提高10 000倍以上[222].这种基因编辑技术仍然有障碍需要克服，即如何将它高效地运送到人体内.2016年，科学家们首次发现了CRISPR-Cas9的“关闭开关”.研究小组鉴定出了3个天然存在的、能够抑制Cas9酶的蛋白质家族(AcrIIC1、2、3)，这些抗CRISPR蛋白能够被用作人类细胞基因编辑的有效抑制剂[223].这个“关闭开关”在基因编辑完成后被打开，所以我们可以利用抑制Cas9的抗CRISPR蛋白来减少脱靶效应的发生[224].抗CRISPR蛋白也可用于限制基因编辑对特定组织或发育阶段的活性来提高基于Cas9的基因组编辑技术的安全性和效率.CRISPR-Cas9的基因组编辑方法一直依赖于同源重组修复的细胞机制，然而这种修复效率很低，而且经常在断裂点附近引入错误的碱基，从而使得它不适合用于点突变治疗性地校正.David Liu团队[225]将dCas9和胞嘧啶脱氨酶进行融合，构建出一种实现C→T准确替换的单碱基编辑器.Kouno[226]和Kim团队[227]分别通过优化胞嘧啶脱氨酶和dCas9的性能来改善单碱基编辑的适用范围和准确性.A→G的腺嘌呤碱基编辑器也已经被David Liu团队开发，其极大地扩展了单碱基编辑的范围，并与先前描述的单碱基编辑器一起在基因组DNA实现可编程的所有4种碱基转换(C→T，A→G，T→C和G→A)[228].这种方法不仅无需剪切核苷酸链产生双链裂口，还克服了靶基因座大量片段的随机插入和缺失问题，同时脱靶效率大大地降低.利用单碱基编辑将病毒DNA进行逐点突变修饰，覆盖错误或有意转化为非编码病毒蛋白质序列可能是CRISPR-Cas9应用于抗病毒继续探寻的另一个新的方向.这些改善特异性的最新研究使得CRISPR- Cas9技术更加接近于临床应用，在降低脱靶效应的副作用同时又能保持高效的治疗效果(图 2).

Cas9中切割结构域中的突变体：dCas9丧失了切割DNA的性能，其可与转录抑制结构域融合来阻断靶基因转录(CRISPRi)或与转录激活结构域结合来激活转录(CRISPRa).除了激活潜伏病毒和抗病毒因子或抑制病毒关键基因的表达外，CRISPRi和CRISPRa技术在病毒学研究中还有多种潜在应用.CRISPRa和CRISPRi可以快速有效地筛选异常表达对病毒适应性和宿主细胞的侵入有显著影响的宿主基因.CRISPRa比cDNA表达筛选具有很多优势例如，gRNA比cDNA规格更小，可以更容易更经济地来建立文库；gRNA比cDNA更容易被递送到目标细胞中；gRNA可以上调基因亚型的表达.CRISPRi也许可以适用在传统CRISPR-Cas9或siRNA筛选难以进行研究的领域如筛选长非编码RNA(lncRNA)，因为lncRNA在RNA水平上起作用，并且NHEJ诱导的插入或缺失突变通常不足以阻断lncRNA的功能.同样，lncRNA功能的RNAi筛选由于脱靶效应和不稳定的敲除效率的存在也具有挑战性[229].CRISPRi可适用于感染细胞的病毒基因组中存在多个拷贝位点的功能丧失研究和评估宿主细胞增强子在病毒感染细胞中的重要性的研究(图 2).

过去的20年里，PCR检测和DNA测序方法的进步促进了对多种传染病的准确而快速的诊断，并有助于监测抗病毒治疗的效果(如由HIV和巨细胞病毒引起的感染).然而，我们现有的诊断设备距离快速、可靠、易于使用并且价格低廉的诊断方法仍然有很大的差距.最近，张锋团队[230-231]利用特异性靶向RNA的Cas13a的附属效应(一旦靶向目的RNA，Cas13a具有了非特异性的RNAse活性便会开始切割临近相关的RNA序列)开发出一种快速检测具有单碱基特异性的核酸检测系统——SHERLOCK.SHERLOCK可以高灵敏度检测寨卡病毒和登革热病毒的特定菌株，还能区分这两种相近的病原菌.Cas9-Cas13a组合展示出同时筛选宿主和RNA病毒基因组的潜力.由于Cas9和Cas13a的脱靶图谱可能是有差异的，所以Cas13a的分析也可以用于Cas9筛选的验证研究，其中一致的表型将提示靶向特异性.最近，Doudna团队[232]发现结合双链或单链DNA的Cpf1具有切割任意单链DNA的活性，将其与等温扩增技术相结合开发一种新型检测系统——DETECTR.和SHERLOCK类似，DETECTR能够以高灵敏度和特异性检测任何DNA序列.这些新技术的开发将推动宿主-病原体相互作用的遗传基因分析的发展，使得病毒如何利用宿主因素这个最根本的问题更加容易得到解答.

CRISPR-Cas9在疫苗研发方面同样具有巨大的潜力.哺乳动物细胞系被用于大多数疫苗的生产过程，使用基于CRISPR-Cas9全基因组筛选来鉴定影响病毒复制的宿主基因的研究，可用于创建新一代稳定的高性能疫苗生产细胞系.带有CRISPR- Cas9介导的基因(抑制病毒复制的宿主基因)敲除的疫苗细胞系比siRNA敲除的细胞系表现出更强的病毒复制的性能并且不改变病毒的抗原性[39].疫苗生产的提高促进更多本地化的小型生产设施的发展，它们通过最小化冷藏、包装和运输要求来进一步降低成本.

综上所述，这些最新的研究将推动CRISPR- Cas9系统应用于传染性疾病治疗新时代的到来，作为基因组编辑方法的CRISPR-Cas9技术的快速发展，使得传染性疾病被深入系统地研究以及发现创新的预防和治疗干预手段.因此，CRISPR-Cas9系统可能是人类在抗击多种抗药性病原体和引发全球所有死亡人数1/4的流行病爆发的战斗中迫切需要的武器.我们可以将CRISPR-Cas9技术与前沿的干细胞相关的再生医学技术或合成生物学技术相结合，来降低其在人体的副作用以及人体免疫系统对其的抗性.在未来几年该领域进一步发展的另一重点将是提高CRISPR基因编辑的特异性以及CRISPR-Cas9基因编辑评估方法的标准化.尽管研究者们在理解CRISPR-Cas9功能方面取得了很多重要进展，但许多核心问题仍然模糊不清.有趣的发现是CRISPR-Cas9在细菌中不仅起到适应性免疫系统的作用，而且对于疾病的发生似乎也很重要[132].这也留给我们更多的机遇来探索CRISPR-Cas9未知的生理功能，进而充分发挥其抗病原体的作用.