经典案例 | I-SPY2乳腺癌药物临床试验采用RPPA技术建立药物响应相关分子分型

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研究背景

肿瘤的分型模式是以指导有效治疗为导向，目前，乳腺癌的亚型模式是采用激素受体（HR）、人表皮生长因子受体-2（HER2）的表达状态来进行分子分型，同时也预测其内分泌治疗、抗 HER2 靶向治疗等疗效。近年来，乳腺癌的新型靶向治疗的快速发展，极富前景，包括 PARP 抑制剂、PI3K 抑制剂、mTOR 抑制剂及免疫治疗等，但 HR 和 HER2 的状态并不足以精准预测这些新型治疗的疗效。因此，基于目前已有的新型治疗策略对乳腺癌进行再分型迫在眉睫。

I-SPY2 试验平台是一项针对高风险早期乳腺癌的持续多中心、II 期新辅助试验平台，基于影像和分子分析预测新辅助治疗效果的适应性系列研究。开始于 2010 年 1 月，预计于 2031 年结束研究，横跨 20 年时间，涉及 28 个治疗策略。试验评估了包括泛 HER2 小分子抑制剂、抗 HER2 治疗、PARP 抑制剂、AKT 抑制剂、免疫治疗、抗血管生成、IFG1R 抑制剂及 HSP90 抑制剂联合化疗等新型治疗方案。至 2021 年 9 月，1979 例病人入组 I-SPY2 研究共评估了 20 种新的治疗药物/策略的疗效，其中 16 种新治疗已完成评估。

近期一项I-SPY2乳腺癌药物临床试验研究，利用药物治疗前基因表达谱分析、蛋白表达及磷酸化水平分析(基于RPPA技术进行)和来自I-SPY2新辅助平台试验(NCT01042379)的临床数据，创建了一种替代乳腺癌分子分型，结合临床样本激素受体(HR)和HER2(人表皮生长因子受体-2)的状态，以更好地预测药物响应。同时在《Cancer cell》杂志上（IF：38.585）发表题为“Redefining breast cancer subtypes to guide treatment prioritization and maximize response : Predictive biomarkers across 10 cancer therapies”的文章。文中研究者评估了接受10种针对不同肿瘤生物学特性的方案治疗后的987例患者，评估了多种药物作用机制相关生物标志物的预测性能。研究者探索了11种分型模式，并确定了能够最大限度提高患者病理完全应答率(pCR)的治疗方法与亚型的配对关系。这些最新的数据提供了前所未有的资源和一种全新的临床分型模式，并支持使用基于药物响应性的分子分型来指导未来不同药物治疗的优先级。

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实验设计

图1

共有来自I-SPY2临床试验的10个臂(Arms)的987例患者被纳入本项研究（图1A），这些患者分别接受了 I-SPY 2 试验平台的 10 种不同的治疗：对照组（n = 210）；维利帕尼（PARP 抑制剂）/卡铂治疗组（n = 71）；奈拉替尼治疗组（n = 114）；MK2206（AKT 抑制剂）治疗组（n = 93）；Ganitumab（IGF1R 抑制剂）治疗组（n = 106）；Ganetespib（HSP90 抑制剂）治疗组（n = 94）；Trebananib（AMG386， 血管生成抑制剂）治疗组（n = 134）；TDM1/帕妥珠单抗组（n = 52）；帕妥珠单抗组（n = 44）；帕博利珠单抗组（n = 69）。其中HRHER2+−肿瘤患者占38%，HR−HER2− (triple negative [TN])肿瘤患者占37% ，HER2肿瘤患者占25% (其中HR+−占9%，HR占16% )。就MammaPrint (MP) 状态来看，MP1亚类患者占51%，MP2亚类患者占49%。其中6个组在一个或多个受体亚型（紫色条）内研究终点达到预设目标阈值，3个组在没有达到预设目标阈值时达到最大累积（图1B）。研究结果发现：即使在疗效最佳的治疗组，仍有 70% 的 HR+HER2-，40% 的 TN，54% 的 HR+HER2+，和 26% 的 HR-HER2+ 的病人未能达到 pCR，提示需要一种新型的工具来预测疗效和精细化分型（图1C）。

RPPA(Reverse Phase Protein Array)反相蛋白微阵列技术是一种结合平面高精度大规模样品蛋白抗原微阵列打印和抗体检测的高通量蛋白组学技术，该平台作为The Cancer Genome Atlas (TCGA)的核心蛋白组学技术平台，承担了33种癌种、超过10000例临床样本的数据的采集与分析工作，其相关研究成果发表在Nature、Cell、Cancer Cell、New England Journal of Medicine、Nature Biotechnology等学术杂志的高水平论文多达500篇以上。

RPPA技术平台设计严谨精密，流程高度自动化，质量控制极其严格，每次进行样品蛋白抗原微阵列打印，都会将多种阳性标准细胞系样品与待分析样品一起进行点阵，确保实验结果的高度可追溯、高度可信度与可重复性。RPPA可在15毫克组织中(米粒大小)一次性分析多达500种以上不同丰度蛋白，且抗体反应过程及靶点信号采集彼此独立，避免了不同靶标抗体反应之间的串扰及不同靶标丰度差异较大带来的信号采集无法兼容的问题，具有其它高通量蛋白组学所无可比拟的超高特异性和灵敏度，可以对大量细胞表面受体蛋白、细胞信号关键蛋白及蛋白修饰(磷酸化、乙酰化、甲基化等)、蛋白酶类、转录因子等各类代表性靶标进行分门别类的系统深度检测，也可根据需求定制所需研究的靶点蛋白进行分析，包括直接和间接的上下游蛋白网络分析。RPPA可应用于蛋白功能与调控机理分析、细胞信号转导全景扫描、肿瘤标志物及蛋白分子分型、药物靶标发现与药物机理分析等不同领域。

03

研究结果与研究结论

1. 采用mRNA/RPPA 综合数据集来构建预测生物标志物

本研究采用超过 19000 基因的 RNA 表达谱芯片（Agilent）检测所有患者治疗前的肿瘤组织，同时，定制 139 个关键蛋白的高通量蛋白表达谱芯片（LCM-RPPA）检测 736 例患者肿瘤组织（除 Ganitumab 和 Ganetespib 治疗外的其他患者），以及收集相关的临床信息（HR，HER2，MP 和治疗反应及其治疗组）（图1D）。

基于肿瘤发生发展机制来筛选 27 个预定义特征来构建新型生物标志物。其涵盖 DNA 修复缺陷（DRD；n = 2），免疫激活（n = 8），ER 信号通路(n = 2)、HER2 信号通路 (n = 4)、增殖 (n = 3)、（磷酸化）AKT 和 mTOR 激活 (n = 3) 以及血管生成素/Tie-2 信号通路 (n = 1) 等。

在采用这些生物标志物的非监督聚类热图中（图2），尽管患者在很大程度上按 HR/HER2 受体分类而聚集，但各组之间存在交叉，这突出了这样一个事实，即对于这些患者，除 HR/HER2 信号外的生物信号通路可能是一个更强的共同点。此外，HR/HER2 不同分型都同时覆盖免疫高和免疫低信号的特征。然后采用逻辑回归来分析 27 个预定义特征与 pCR 之间的相关性，并根据 HR，HER2 状态及治疗组进行调整。

图2

总体来说，免疫激活、增殖及 ER 信号通路的生物标志物有着较为广泛的预测价值。但不同的治疗药物和分子分型，其最佳免疫生物标志物存在差异。例如，在 HER2+ 亚群中，B 细胞相关基因特征可以预测 MK2206 和奈拉替尼的响应，但在其他组中预测价值不足。

在 TN 亚群中，最佳的预测性的免疫生物标志物是树突状细胞、STAT1/细胞因子 12 相关的基因特征，其对帕博利珠单抗、血管生成抑制剂 trebananib 具预测价值。增殖相关的生物标志物，如 MP 指数、basal 指数和 module11 增殖评分在大多数治疗组（除外 TN 和 HR-HER2+）中有着预测价值，与 pCR 有着明显相关性。

Luminal/ER 生物标志物，如 BluePrint-Luminal 指数，ER 特征可预测 HR+HER2-患者的耐药。在不同的分子分型中分析发现，特异性最强的生物标志物可能并不是最具预测价值的，磷酸化的蛋白水平有着更高的预测价值，在不同的分子分型中预测相同药物的生物标志物有所不同。

2. 初建药物响应预测亚型模式以匹配相应治疗

基于原有的免疫组织化疗和固有亚型的特征基础上，增加 27 个预定义特征，可进行更精细的再分型。鉴于上述生物标志物对 I-SPY2 研究中不同药物治疗的疗效预测价值，建立并优化了 11 种以上药物响应预测亚型模式的框架（图3）。

图3

首先，基于 DNA 修复缺陷 (DRD)/铂类的响应和免疫相关标志物来构建三阴性乳腺癌的响应预测表型（图4）。响应预测亚型模式定义为 Immune+ 患者与以往认定的免疫富集型的人群有着较大的重叠性。Immune+ 的 TN 患者接受帕博利珠单抗的 pCR 率高达 89%，DRD+ 的 TN 患者接受维利帕尼/卡铂治疗的 pCR 率高达 75%。在这一组患者中，免疫和 DRD 生物标志物有较大重叠，其中 56% 的 TN 中这两种生物标志物都很高。

在 Immune+/DRD+ 的病人中，分别接受维利帕尼/卡铂、帕博利珠单抗均有着较高的 pCR 率：74% 和 92%。而在 Immune+/DRD-和 Immune-/DRD+的病人中，接受帕博利珠治疗或维利帕尼/卡铂治疗的 pCR 均为 80%。对于 Immune-/DRD-的 TN 病人，上述药物的疗效不佳，pCR 不足 21%。

HR+HER2-亚群中，采用 DRD 和免疫特征来进行分析时发现，不同亚型的占比与 TN 亚群有所不同，但其 pCR 率的差异模式与 TN 亚群相似。而对于 HER2+亚群，由于 BluePrint 检测的 Luminal 指数或是 ER 相关基因特征，与单独抗 HER2 治疗的低 pCR 率呈明显相关，于是采用 BluePrint 检测来重新划分 HER2+病人以定义为响应预测表型。

图4

为方便临床实践和应用，遂通过一系列合并将响应预测亚型简化合并为 RPS-5 集合：包括HER2-/Immune-/DRD-，HER2-/Immune-/DRD+，HER2-/Immune+，HER2+/BP-HER2 或 Basal，以及HER2+/BP-Luminal等5种。例如：由于 HR+HER2- 和 TN 亚群中的所有 Immune+患者的最佳治疗为帕博利珠单抗，可达最高的 pCR，因此这部分患者合并为单一亚型 HER2-/Immune+。

另将TN/Immune-/DRD+和HR+HER2-/Immune-/DRD+患者合并为 HER2-/Immune-/DRD+ 亚型，因为这些亚群接受维利帕尼/卡铂可达最高的 pCR。使用 HR/HER2 分型发现各型的最高 pCR 的治疗分别为：帕博利珠单抗治疗的 HR+HER2-和 TN（pCR：30% 和 66%）；曲帕双靶治疗 HR-HER2+（pCR 率为 80%），TDM1/P 治疗 HR+HER2+（pCR 率为 51%）。

当使用 RPS-5 进行再分型后，再次计算 pCR 率。HER2-/Immune+的最佳药物为帕博利珠单抗，pCR 可高达 79%；维利帕尼/卡铂用于 HER2-/Immune-DRD+治疗，pCR 可达 60%；THP 用于 HER2+/BP-HER2 或 Basal 的 pCR 可达 78%，MK2206 用于 HER2+/BP-Luminal，pCR 为 60%，用于 HER2- /Immune- /DRD-的 pCR 为 20%（此亚型患者在所有治疗臂中疗效不佳）。

3. 精细化分型模式最大限度地提高试验人群的 pCR 率和获益

药物响应预测亚型模式的一个主要目标是最大限度地提高人群的 pCR 率，及提升个体患者达到 pCR 的概率。为进一步验证 RPS-5 模式，采用计算机进行已有的 I-SPY 2 平台的大数据的深入分析如果患者基于 RPS-5 再分型来接受相应的治疗策略的总体 pCR 率（图5）。

图5

在 I-SPY2 的标准治疗臂的总体 pCR 率为 19%，而在 9 个试验臂中，总 pCR 率为 35%，比对照组增加了 16%。如果患者根据 HR/HER2 受体亚型被分配到最好的试验治疗臂，试验臂的总体 pCR 率为 51%，提示可将 pCR 进一步提高 16%。

最后，如果采用 RPS-5 进行分型，并将患者分配到相应的最佳治疗中，联合试验臂的总体 pCR 率将为 58%，进一步提升 7%。同时，分析发现 RPS-5 再分型后，达到 pCR 的患者有着明显的 DRFS 的生存获益，但在不同的分型中获益不同，其中 HER2-/Immune-/DRD+, HER2-/Immune+, and HER2+/BP-HER2 或 Basal 从 RPS-5 再分型后，达到 pCR 患者的生存获益更为明显。

由此可见，RPS-5 再分型后 pCR 率的提升幅度在 HR/HER2 亚型中的分布并不均匀：在 HR-HER2+患者接受 RPS-5 再分型为 HER2+/BP-HER2 或 Basal 亚型后并未有 pCR 的提升；但如果是 HR+HER2+患者接受 RPS-5 再分型后 pCR 率可从 51% 提高至 67%。

除了提高人群的应答率外，一个良好的分型模式还应该在广泛的治疗类别中区分有响应者和无响应者。采用修正偏差相互信息分析比较不同分型模式的预测 pCR 的能力，对于大多数治疗臂，相较起 HR/HER2 的分型，RPS-5 更具预测 pCR 的效能。

4. 适应于新型治疗格局的药物响应预测分型模式

在未来在试验中增加新的药物类别可能需纳入额外的生物标志物，并需要对分类方案进行修订。例如，目前 HER2 低表达成为研究的热点，也正改变着乳腺癌的治疗格局，I-SPY2 平台有正在针对 HER2 低表达的治疗药物的研究，由于增加了 HER2 低表达的定义，遂将 HER2 的表达状态从二分类变为了三分类，因而在 RPS-5 的基础上更新为 RPS-7，分别为：

S1: HER2+/BP-HER2 或 Basal

S2: HER2+/BP-Luminal

S3: HER2 = 0 或低表达/Immune+

S4: HR-/HER2 低表达/Immune- /DRD-

S5: HER2 = 0 或低表达/Immune- /DRD+

S6: HER2 = 0/Immune- /DRD-

S7: HR+/HER2 低表达/Immune- DRD-

七种分型的最高 pCR 率依次为：THP (78%), MK2206 (60%),Pembro (79%), ganitumab (40%), VC (60%), N or MK2206(20%), 和 MK2206 (20%)。由此可见，即便没有针对 HER2 低表达的治疗药物，RPS-7 再分型，相比起 HR/HER2 受体分型，pCR 率可提高 11%。

图6

基于RPS-7和包含其他3种状态HER2的疗效预测模式也表明，当引入一种新的药物（如HER2低表达相关抑制剂）时，提高pCR率的最低疗效强烈依赖于它被测试的生物标志物子集。例如，在RPS-7中，HER2低表达患者分为4组（RPS-7类S3-S5和S7），在目前的I-SPY2患者中，最有效药物的pCR率为20%到70%。此外，其他的HER2低表达亚型可能包括所有HER2低表达或HR+/HER2低表达（图7A）。

如果在HR+/HER2-low/Immune-/DRD-组进行测试，那么HER2低表达相关药物必须达到20%的pCR率，才能超过目前为止试验中测试的任何药物所能达到的最大药物响应（图7B）。在I-SPY2试验中，该亚集占所有HER2-的20%和HR+HER2-患者的38%。相比之下，如果开发人员在所有HER2低表达患者中测试该药物，那么，尽管患病率更高（占HER2-患者的65%），但在 I-SPY2药物最低疗效对应的pCR增加44%（图7B）。

图7