单细胞测序原理10X UMI Barcode

什么是单细胞测序

单细胞RNA-Seq提供成千上万个单个细胞的 transcriptional profiling。这种水平的通量分析使研究人员能够在单细胞水平上了解哪些基因表达，多少数量以及异质样品中成千上万个细胞之间的差异。

目前，测序可以回答以下6类问题：

DNA的序列：ATCG怎么排列，以及各序列的丰度；

DNA的表观遗传修饰：比如甲基化、羟甲基化，以及组蛋白的各种修饰；

RNA的序列：AUCG怎么排列，以及各序列的丰度；

RNA的表观遗传修饰：比如近年很火的m6A修饰；

染色质的结构：3C、4C、5C等各种C；

其他魔性应用：比如DNA损伤位置、蛋白-蛋白相互作用等。

单细胞测序，就是想办法在单细胞层面去回答以上6类问题。

为什么非用单细胞测序不可？
世界上没有两片相同的叶子。对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异的。当然了，这个差异可大可小。
比如说，受精卵从一个细胞开始分裂，并逐渐形成囊胚，最终发育成个体的时候，细胞与细胞之间的差异会越来越大：有的分化成神经元，有的分化成骨骼肌，各自表达着不同的遗传信息，承担着不同的生理功能。
又比如在肿瘤组织中，肿块中心的细胞，肿块周围的细胞，淋巴转移灶的细胞，以及远端转移的细胞，其基因组和转录组等遗传信息，是存在差异的。而这种差异，在临床上，可以决定该肿瘤对某种疗法是否有效。

这就是所谓的遗传信息的异质性。（异质性是遗传学概念，一种遗传性状可以由多个不同的遗传物质改变所引起。）
单细胞测序可以得到不同细胞/单个细胞的异质性信息，可以探究细胞各自表达着不同的遗传信息。
传统的研究方法，是在多细胞水平进行的。因此，最终得到的信号值，其实是多个细胞的平均，丢失了异质性的信息。

怎么做单细胞测序

根据介绍可以采用流式细胞仪

基于标签（barcode）的单细胞识别。它的主要思想是，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。

一个油滴=一个单细胞=一个凝胶微珠=一个RNA-Seq，可以说这就是10X的基本技术原理。

V2试剂盒产生的文库结构：

• reads 1 ：主要用来定量（barcode、UMI以及reads的来源）
• reads 2 ：与基因组比对
• Barcode:标记细胞
• UMI （Unique Molecular Identifier）：标记基因
• PolyT ：真核生物

10X genomics单细胞测序通过Barcode来标记细胞，UMI 来标记转录本，这样与参考基因比对后就可以定量细胞以及基因的数量。

UMIs

为了减少由于扩增引起的误差，人们在一些单细胞测序的步骤中增加了 UMI（unique molecular identifiers），UMIs 是由 4-10 个随机核苷酸组成的序列，在 mRNA 反转录后，进入到文库中，每一个 mRNA，随机连上一个 UMI，因此可以计数不同的 UMI，最终计数 mRNA 的数量。

10X genomics单细胞测序通过Barcode来标记细胞，UMI 来标记转录本，这样与参考基因比对后就可以定量细胞以及基因的数量。
Cell Ranger 进一步将外显子reads与参考转录本比对，寻找兼容性。注释到单个基因信息的reads认为是一个特异的转录本，只有注释到转录本的reads才用于UMI计数。

在逆转录的过程中，有些方案利用独特分子标识符（UMI）对单分子进行标记，这些是随机的六核苷酸，可以更精确地定量单细胞中mRNA分子的初始量。之后，通过体外转录或PCR扩增cDNA，然后将扩增好的cDNA文库用于文库制备和高通量测序。

另一种标准化方法是使用 Unique Molecular Identifiers (UMIs)(Kivioja et al. 2012). UMIs是一种随机条形码（barcode）序列，长度在4-20 bp之间。 在扩增步骤之前（通常在反转录期间），UMIs被添加在每个转录本cDNA的3’或5’端。之后，对转录本末端进行靶向测序。这些barcodes使得在扩增步骤之前，可以对转录本进行定量。虽然UMIs消除扩增偏好性的效果非常好，但是不合适用于研究基因异构体和allel特异表达。

Barcode

Barcode : 每一个单细胞的cDNA文库，就带上了独一无二的barcode了,barcode是用来区分细胞的，跟umi不同。
UMI：（Unique Molecular Identifiers）是短序列，用于唯一标记样品库中的每个分子。UMI被广泛用于测序应用，大多关于DNA和cDNA的PCR重复。UMI去重复还可用于RNA-seq基因表达分析和其他定量测序方法。简而言之：UMI是唯一可识别的短序列，作为UMI是唯一的，所以我们可以知道在PCR扩增的过程中哪些是由同一条DNA扩增出来的。

基于标签（barcode）的单细胞识别，给每个细胞加上独一无二的DNA序列，这样在测序的时候，就把携带相同barcode的序列视为来自同一个细胞了。这种策略，可以通过一次建库，测得数百上千个单细胞的信息。

每一个油滴中会落入一个细胞以及一个凝胶微珠，那么在每一个凝胶微珠中上长满了不同的Cell Barcode和UMI Barcode连接形成的序列，再加上一端PolyT的抓手，构成我们的捕获凝胶微珠。而这个凝胶微珠抓手就会使用oligo dT抓住mRNA构建文库。

10X的基本技术原理：一个油滴=一个单细胞=一个凝胶微珠=一个RNA-Seq
BD的基本技术原理：一个微孔=一个单细胞=一个磁珠=一个RNA-Seq