单细胞注释之坑-通过AddModuleScore注释细胞

兜兜转转,小编做单细胞转眼又是半年过去了,单细胞注释真的是一到玄学,一查资料很多自动化单细胞注释的工具横空出世,可是小编试了很多很多,发现还是手动注释更加准确,但是手动如何注释呢?
这里我们需要先找到细胞的marker基因,这里以NKT细胞为例,我们知道NKT有三个经典的marker(CD45,CD3,CD56),我们单个marker注释看看
这里的sce就是我们前面使用seurat创建的对象

FeaturePlot(sce,features = c('PTPRC','CD3D', 'CD3E', 'CD3G', 'NCAM1'),
            pt.size = 0.1,reduction = 'tsne',ncol = 5)

单细胞注释之坑-通过AddModuleScore注释细胞_第1张图片
从上面的图中可以看出,右上角为T细胞,NKT细胞在哪里呢,我们需要看一下交集的地方
单细胞注释之坑-通过AddModuleScore注释细胞_第2张图片
同样是这几个marker,我们使用该包自带的AddModuleScore进行计算,同时绘制多个marker的TSNE图

NKT_gene_list <- list(c('PTPRC','CD3D', 'CD3E', 'CD3G', 'NCAM1'))
sce <- AddModuleScore(object = sce, features = NKT_gene_list, name = "cell")
FeaturePlot(object = sce, features = "cell1",reduction='tsne',
                    cols = c('grey','red'))+
  ggtitle('NKT cell \n CD45(PTPRC), CD3(CD3D, CD3E,CD3G), CD56(NCAM1)')

单细胞注释之坑-通过AddModuleScore注释细胞_第3张图片
这里指定的NKT在右上角
单细胞注释之坑-通过AddModuleScore注释细胞_第4张图片
看到这里突然不知道说啥了,小编查 了一下AddModuleScore的原理,原来AddModuleScore是通过特定的方法通过这几个marker计算的评分,(其实就是这几个基因的平均表达值)对于Bulk RNA-seq的数据当然没有什么问题,但是对于单细胞来说,他是一个很大的稀疏矩阵,包含了大量的0,在取平均的时候,将高表达的细胞反而缩小了,低表达的细胞整体拉大了,加上每一个marker在细胞注释的时候占的权重不一样。
我们要确定NKT,就需要先看CD45是否表达(免疫细胞),再看CD3(T细胞),最后看CD56(NKT),但是通过AddModuleScore的方法认为这些marker的一样重要的,所以才会造成现在的情况。
换言之,除非能得到一种算法,就像流式手动圈门一样,从大类开始注释,直到小类结束,不然我们又该如何去衡量这个marker的权重呢?
玄学一般的单细胞注释,不一样的注释不一样的结果,我曾经使用garnett包进行分析,区分单个细胞,并进行注释(因为小编一直觉得不管怎么聚类,cluster都是杂的,不可能纯),可是结果总是差强人意。直到现在才明白,为什么garnett会失败,其实和AddModuleScore的一样的,还是那句话,marker权重不同,他们不知道哪个marker对于亚群权重更高,所以,面对这些只有一个方法,有交集的基因不要放,亚群之间一定要找独有的marker,但是这个又如何容易呢?大亚群可以,小亚群呢?先注释大亚群后注释小亚群吗?

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