抗原检测试剂盒原理

原理

新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白和S蛋白等抗原，可作为免疫原，在病毒感染人体后，刺激浆细胞产生特异性抗体。依据双抗夹心ELISA原理，样本滴加在样本垫上，通过液相层析依次通过结合垫，NC膜上的检测线（T线）和质控线（C线）。结合垫内含有标记的抗原特异性抗体，可以与样本中的抗原（病毒蛋白）发生结合，当液流到达检测线（T线）时，固定在这条线上的第二种抗原特异性抗体再次与抗原结合，将会呈现阳性结果。质控线（C线）包被IgG抗体，可以结合样本垫中抗体，用于判断层析过程是否顺利。

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三种方法

荧光免疫层析法

荧光免疫层析技术是基于[抗原抗体]特异性[免疫反应]的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线(包被抗体或包被抗原)和质控线(抗抗体)的条状纤维层析材料为[固定相]，测试液为[流动相]，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个[抗原决定簇]的大分子抗原([蛋白]、[病毒]、[致病菌]等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，当到达检测线时再与包被抗体结合形成双抗夹心的“三明治”型。

• 应用
  多用于食品质量安全快速检测分析研究。

• 标记物

（1）荧光素
（2）量子点

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（3）上转换纳米粒子

胶体金法

胶体金法是由氯金酸(HAuCl4)在[还原剂]如[白磷]、[抗坏血酸]、[枸橼酸钠]、[鞣酸]等作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，并由于[静电作用]成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金也是[免疫电镜技术]中较为理想的免疫标记物。

• 基本原理
  胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的[正电荷][基团]形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它[生物大分子]结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高[电子密度]、颗粒大小、形状及[颜色反应]，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、[组织学]、病理学和细胞生物学等领域。 胶体[金标]记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从[氯金酸]制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与[葡萄球菌A蛋白]、[免疫球蛋白]、毒素、[糖蛋白]、酶、抗生素、激素、[牛血清白蛋白]多肽缀合物等非共价结合，因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling technique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些[标记物]在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，因而用于定性或[半定量]的快速免疫检测方法中，这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。
• 制备方法
  用容量瓶量取200ml超纯水加入到 500ml锥形瓶中，将锥形瓶置于[磁力加热搅拌器]加热板上，放入磁力搅拌子，打开搅拌旋钮至适当速度。用移液器吸取2ml 1%氯金酸溶液于上述 200ml超纯水中，搅拌1min，关闭搅拌旋钮，打开加热旋钮，加热至沸腾。打开搅拌旋钮至适当速度，快速加入经[微孔滤膜]过滤。1% 柠檬酸三钠溶液0.8ml，溶液在2分钟内由灰色变黑色最后变为红色，再继续加热搅拌 10分钟。关掉加热旋钮，适当速度搅拌至室温，定容至200ml，4℃保存。
• 应用
  （1）免疫胶体金光镜染色法 细胞悬液涂片或组织切片，可用胶体金标记的抗体进行染色，也可在胶体金标记的基础上，以银显影液增强标记，使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面，可明显增强胶体金标记的敏感性。
  （2）免疫胶体金电镜染色法 可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合，然后进行负染。可用于病毒形态的观察和病毒检测。 斑点免疫金渗滤法
  （3）应用微孔滤膜（如膜）作载体，先将抗原或抗体点于膜上，封闭后加待检样本，洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应的抗原或抗体。
  （4）胶体金免疫层析法 将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂（抗体或单克隆抗体）吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。该法现已发展成为诊断试纸条，使用十分方便。

乳胶法

乳胶凝集法( Latex agglutination test，LAT) 是以乳胶颗粒作为载体的一种间接凝集试验。即吸附可溶性抗原于其表面，特异性抗体与之结合后，可产生凝集反应。这种方法具有独特优点: 不需要特殊仪器、肉眼判断、操作简便、不需要专门培训；检测时间短，一般为 2 min；价格低廉，检测单份血清样品的成本比其它血清学和病原学方法低得多；适于现场检测等，在临床检验中被广泛应用。

• 原理
  普通聚苯乙烯乳胶和抗体的结合是无选择性的物理静电吸附，抗体很难结合到乳胶表面，即使致敏上的抗体也容易从乳胶微球上脱落或者变性失活，而使用多肽缩合剂或交联剂则操作过程繁琐、耗时。
  研究以带有磺酸基的三元聚合物乳胶微球为载体,获得单分散性好的乳胶，通过调节 p H 值后乳胶微球表面带有较多的电荷，易吸附抗体。将单克隆抗体吸附到乳胶表面，制备乳胶抗体复合物诊断试剂。这种方法克服了普通乳胶致敏抗体的缺点，不需使用交联剂，提高了抗体的结合效率，而且致敏上的抗体不容易从乳胶上脱落，进而提高乳胶的敏感性和保质期，适合产品开发和大规模生产的要求。
• 应用

1. 乳胶凝集法可用于猪圆环病毒的快速检测
2. 快速检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）
3. 检测麻疹病毒Ig-M抗体也有较好应用