组织样本微生物检测介绍

人体表面和体内都生活着大量的微生物，其总量甚至超过了人体自身细胞的数量。这些微生物在与宿主长期共存的过程中，逐步形成了独特的动态微生态系统，并在人体健康和各类疾病中都扮演了重要的角色。

对于组织样本中的微生物的早期研究主要采用传统的分离培养方法，来识别和描述微生物群落的组成和多样性。传统方法的局限性使研究者难以正确全面地阐明微生物的群落结构和多样性特点。而近年来发展出来的高通量测序技术从根本上改变了人们对微生物群落的认识，使人们得以系统地分析和认识组织样本中的微生物群落及其功能。基于16S rRNA /ITS基因，优化实验方法，增加对痕量微生物的研究，利用二代测序技术（Roche 454、Illimina MiSeq/novaseq、Ion Torrent PGM）来分析组织样本中微生物的多样性，为全面了解微生物群落的结构特点及其与人体健康的相互关系提供了便利的研究渠道。

在分析组织样本中微生物的群落组成时，必须要考虑到外源性微生物DNA污染的问题，在低生物量的样本中这个问题尤为重要。组织样本中的微生物量一般都很低，因此在设计实验的过程中，每一个步骤中都需要加入不含任何微生物DNA的空白对照样品，避免外源性污染导致分析结果出现偏差。若实验样本的抽提和PCR扩增结果都呈阳性，而所有空白对照的结果都为阴性，则可以证明样本中基本不存在外源性微生物DNA的污染，可以正常地进行后续的测序和分析。

但是对于一些生物量极低的样本，外源性微生物的污染很容易造成目标样本出现假阳性的结果，因此这类样本的处理和PCR过程异常困难。在某些极端的情况下，一个样本的测序结果中有80%的序列都有可能是来自外源污染物的。针对此类情况，现在比较普遍的解决方案就是将空白对照样本和目标样本一起进行高通量测序，根据测序结果，从目标样本中移除那些可能来自外源微生物的序列。

目前已经有几种方法可以用于排除样本中的外源性微生物序列，其中一种方法就是将同时出现在目标样本和空白对照样本中的序列直接去除。此方法的具体操作可以参考下文的案例一。

案例一：Qixing M, Weidong M, Zhongqiu W, et al. Differential flora in the microenvironment of lung tumor and paired adjacent normal tissues. Carcinogenesis, 2020, Volume 41, Issue 8: 1094-1103.

文章对比分析了肺癌患者的肿瘤组织和正常癌旁组织样本中微生物的种类和分布情况，希望可以更进一步了解微生物在肺癌发病过程中所起到的作用。将空白样本与组织样本一起进行基因组抽提和16S V3-V4建库测序。分析测序结果，若某一个OTU在空白样本中的序列数高于1000条，则认为该OTU来自外源性微生物的污染，并将组织样本结果中的此OTU序列排除。

另一种效果更好的方法就是利用分析软件来排除外源性微生物序列，常用的软件为Decontam。该软件通过分析微生物在样本中出现的频率和普遍性来排除外源性微生物序列，其主要判断依据为：来自外源性微生物的序列出现的频率与样本DNA的浓度呈负相关关系，且此类序列在空白对照样本中的普遍性会高于测试样本。使用Decontam进行数据分析的过程可参考案例二。

案例二：Benjamin GW, Bianca K, Kristin JC, et al. Evidence for environmental-human microbiota transfer at a manufactruting facility with novel work-related respiratory disease. American journal of respiratory and critical care medicine, 2020, Volume 202, Issue 12.

此文针对工厂环境和患有新型肺部疾病的工人进行了调查，希望通过此研究能够弄清楚此类疾病的病理机制，并为工人提供更好的工作环境。研究人员对患病工人的肺部组织、呼吸道和皮肤进行采样，同时采集了工厂的环境样本。对样本进行基因组抽提和PCR扩增建库，并且在每一个步骤中都设置了数个空白对照样本。获得测序结果后，利用Decontam软件分析并排除掉样本中的外源性微生物的数据。

微基生物现在可使用Decontam软件对痕量微生物样本的测序结果进行分析。同时我们在以上几种方法的基础上另外开发出了一套全新的专门针对低生物量样本的测序方案，大大提高了此类样本测序的成功率和测序结果的质量。已有客户采用此方法对样本进行测序分析，并成功地在期刊Cancer Cell（IF：31.7）上发表了文章，具体可参考下文案例三。

案例二：Liangqing D, Dayun L, Ran C, et al. Proteogenomic characterization identifies clinically relevant subgroups of intrahepatic cholangiocarcinoma. Cancer Cell, 2022, Volume 40, Issue 1.

对患有肝内胆管癌的病人的肿瘤组织和健康肝脏组织进行采样，并进行蛋白质基因组学分析、RNA测序和微生物16S rRNA高通量测序等多项检测。在采样、基因组抽提和16S rRNA的PCR扩增过程中各设置了6个空白对照样本，将这18个空白对照与组织样本一起进行建库测序，并在后续数据分析的过程中以这些空白对照作为参考，排除样本中外源微生物的污染序列。