高通量二代测序如何建库？

第二代高通量测序也称为下一代测序技术，相比于第一代测序通量更高、速度更快、成本更低，主要有样本制备、文库构建、测序反应等过程。由于原理和技术的不同，二代测序有诸多的测序平台，目前illumina测序在高通量测序科研领域中占主导地位，接下来为大家下面详细介绍illumina平台文库构建

文库构建的主要流程主要包括以下结果环节

 

一．基因组DNA抽提质控      

1.DNA提取的基本原理

 

DNA的提取可以简单的分为裂解和纯化两大步骤，裂解是破坏样品细胞结构，从而使样品中的DNA游离在裂解体系中的过程，纯化则是使DNA与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。

2.DNA提取方法

样品裂解过程

常规的裂解液都含有去污剂和盐等。

• 去污剂的作用
  • 使蛋白质变性；
  • 破坏膜结构；
  • 去除与核酸相互作用的蛋白质。
• 盐的作用
  • 提供合适的裂解环境，如Tris;
  • 抑制核酸酶对核酸的降解，如EDTA；
  • 维持核酸结构稳定，如NaCl。

裂解体系中还可加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进DNA与蛋白质的分离，同时，也便于后续的纯化操作

样品纯化过程

样品纯化过程有酚氯仿纯化，高盐沉淀，离心柱纯化以及磁珠法纯化方法等

（1）.酚氯仿抽提

该方法包括两个步骤：

A：利用酚氯仿对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现DNA与蛋白质的分离；

B：再用醇将DNA沉淀下来，实现核酸与盐的分离。

酚氯仿抽提是去除蛋白质的有效手段，但如果蛋白质含量超过了其饱和度，裂解体系中的蛋白质就不会被一次性去除，需要进行多次反复抽提，

（ 2）高盐沉淀法

高盐沉淀法是酚氯仿抽提方法的一个变种，其省略了酚氯仿抽提操作的麻烦，降低了核酸的损失，只是得到DNA的纯度不够稳定。    

 （3）离心柱纯化

离心柱纯化方法利用某些固相介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离，

（4）磁珠法

磁珠法将纯化介质包被在纳米级的磁珠表面，通过介质对DNA的吸附，在外加磁场的作用下使DNA附着于磁珠并定向移动，从而达到核酸与其它物质分离的目的

 

 3.DNA质控

   将纯化后的DNA进行琼脂糖电泳检测。

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。Gelred染料可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。

二、设计并合成引物接头

根据illumina高通量测序要求，进行双向测序，设计目标区域和带有“5’接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。并采用两步PCR扩增的方法构建文库。

 图来自illumina官方

三、靶基因PCR扩增与纯化

第1步：目标基因的获得.

先简述一下PCR扩增原理，pcr扩增又称聚合酶链式反应，PCR的过程可看作是生物体外的特殊DNA复制，能将微量的DNA大幅增加。

PCR的三个步骤分别是1.高温变性:利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，；2.低温退火:低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；3.中温延伸:当调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。

第2步：PCR产物进行纯化

常用的PCR产物纯化方法包括凝胶回收和磁珠纯化

第一种：琼脂糖凝胶回收

凝胶回收的原理：

（1）溶胶：将含有目标DNA的琼脂糖凝胶切除，转移到含有溶解胶块的缓冲液中，这些缓冲液能破坏琼脂糖内部的氢键，从而释放出DNA。（2）吸附：溶解胶块释放出来的DNA，会在高盐浓度、高pH值的环境下吸附在磁珠表面上。（3）洗脱回收：把一些其他杂质通过缓冲液进行漂洗磁珠，DNA就被释放出来了。

凝胶回收的目的：

（1）去除非特异性扩增的产物、（2）去除多余的底物、（3）去除多余的Taq酶、（4）得到目的片段

胶回收的过程：

第二种：磁珠纯化PCR产物

磁珠纯化DNA核心技术是磁珠和DNA相互作用吸附在一起，磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应，当磁珠完全吸附DNA后加入乙醇，乙醇可以洗去核酸中的盐离子。乙醇漂洗后，静置一会，使乙醇完全挥发，这时候加入纯水或者TE buffer，因为体系中已经没有盐离子，磁珠表面的官能团无法吸附DNA,使其从磁珠上洗脱下来，溶解到溶液中。

四．PCR产物定量

PCR产物定量和均一化的目的将纯化后的PCR产物进行实时荧光定量PCR来计算PCR产物的拷贝数，最后根据不同样品PCR产物的拷贝数等摩尔比的混合在一起。

那么什么是qPCR扩增(实时荧光定量PCR)呢？

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

以 PCR产物为模板进行 qPCR，在 qPCR 扩增过程中，通过收集荧光信号，对 qPCR进程进行实时检测。由于在 qPCR 扩增的指数时期，模板的 Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可以定量。所使用荧光化学物质不同，将其分为荧光染料和荧光探针两类。

 

下面以荧光染料法（SYBR Green I）来说明实验

荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量

qPCR扩增曲线：对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。所以在实时荧光PCR扩增完成后，不同的样品的DNA可以得到一个特定的CT值，根据CT值我们可以计算出PCR产物的拷贝数，然后将不同的样本按照等摩尔的比例进行混合。

五、文库构建

将全部的PCR产物按照qPCR定量后的等摩尔比进行混合，再通过PCR扩增的方法进行barcode和测序接头的添加。完成靶基因二代测序的文库构建。