宏基因组分析-基于binning
一、介绍
宏基因组 ( Metagenome) 指特定环境下所有生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因。一般从环境样品中提取基因组DNA, 进行高通量测序，从而分析微生物多样性、种群结构、功能信息、与环境之间的关系等。
宏基因组的分析目前主要包括三种方法：基于组装分析、基于reads分析、基于bin分析。
下面我们介绍基于bin的分析方法。
二、分析流程介绍
宏基因组分箱（Binning）是将序列组装得到的Contigs按物种分开归类的过程。宏基因组分箱技术有助于获得不可培养微生物的全基因组序列，获得新物种的基因组序列和功能，预测未知物种的培养方法等等。
分箱软件通常基于GC含量、核苷酸频率、关键的单拷贝基因序列等组成性特征；丰度分布差异，认为源自同一基因组的序列 (contigs)，在同一样本中应具有一致的丰度，而在不同的样本之间，它们又应该具有相似的丰度分布；两种策略进行分箱。
基于Binning的宏基因组分析流程，数据分析从下机原始序列开始，首先对原始序列进行去接头、 质量剪切以及去除污染等优化处理。然后使用优质序列进行拼接组装得到Contigs；使用metabat2和maxbin2软件分别对每个样本的Contigs进行分箱；不同软件分箱得到的bin进行合并（binning_refiner）、提纯（MAGpurify）；然后将所有样优化后的bin进行去冗余（dRep）；而后分别从物种和功能方面进行信息统计。
三、详细流程
- 数据质量控制，为了提高后续分析质量和可靠性，对原始测序数据进行以下清洗处理， 获取用于后续分析的有效数据(Clean Data)。具体处理步骤如下：使用fastp软件去除质量低的reads，过滤掉质控后长度较低的reads，同时去掉接头序列；如果样品来源于宿主（比如人或动物的粪便），而且该宿主本身的基因组已被发表， 则通过软件Bowtie2软件将reads比对宿主DNA序列，并去除比对相似性高的污染reads；
- 序列组装： 使用Megahit软件使用不同kmer对优化序列进行组装得到Contigs；
- Bin生成：采用metaWRAP环境中binning模块的metabat2和maxbin2方法对contig进行分箱。
- 合并不同软件得到的bin：采用binning_refiner软件将两个软件生成的bin进行合并，重新生成bin，并提纯bin。
- 去冗余和筛选：合并所有样本中得到的bins，用CheckM中的lineage_wf流程评估bins的完成度和污染度，并用dRep软件对bins进行去冗余。
- Bin丰度计算：在metaWRAP环境中，使用metaWRAP的quant_bins模块计算每个Bin的丰度。
- Bin物种注释：使用 PhyloPhlAn3软件将bins与SGB.Jul20比对，获取每个bin的物种分类信息。
- Bin功能注释：基于Prokka软件得到的蛋白序列信息，用emapper软件和eggNOG数据库进行比对，得到COG、KEGG、CAZy、GO的信息，采用ARI软件和CARD数据库进行比对得到抗性基因信息，进行基因个数的统计，并进行可视化。
四、主要分析结果
1、Bin信息统计
Bin信息统计（示例）
第一列：bin编号；第二列：bin完成度；第三列：bin污染度；第四列：Contig N50；第五列：Contig N90；第六列：一个Bin的所有Contig长度之和，即该基因组草图的总长度；第七列：GC含量是指一个Bin中GC碱基占总碱基的比例。
2、GC-depth图
Contig GC含量和depth深度数据即可进行可视化，绘制Bin中每个contig的散点图。此图可以用来判断分箱效果和污染情况。
Binned contigs可视化
注：横坐标是contig的GC含量；纵坐标是contig depth；一个点代表一个contig，相同颜色的contig来自同一个bin。
3、GOLevel2基因数统计
GO提供了一系列的语义（terms）用于描绘基因、基因产物的特点，这些语义通过三个概念维度展开：细胞学组件（Cellular Component）用于描述某个节点的亚细胞结构、位置和大分子复合物；分子功能（molecular function），用于描述基因以及基因产物的功能；生物学途径（biological process）指的是分子功能的有序组合以实现更复杂的生物功能，
GO注释统计图
注：该图说明的是其中一个bin预测基因所属GO的情况；纵坐标是数量；横坐标是GO；颜色是GO分类；柱子越高，该GO中包含的预测基因(CDS)越多。
4、KEGGLevel2基因数统计
KEGG PATHWAY 数据库中，将生物代谢通路划分为 6 类，分别为：细胞过程（Cellular Processes）、环境信息处理（Environmental Information Processing）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）、人类疾病（Human Diseases）、新陈代谢（Metabolism）、生物体系统（Organismal Systems），其中每类又被系统分类为二、三、四层。第二层目前包括有 57个种子 pathway；第三层即为其代谢通路图；第四层为每个代谢通路图的具体注释信息。
KEGG pathway level2水平CDS数量可视化
注：横坐标是KEGG level2水平CDS数量；纵坐标是KEGG level 2名称；颜色用于区分KEGG level 1的类型。
4、COG各类别基因数统计
COG，即Clusters of Orthologous Groups of proteins（同源蛋白簇）。COG是由NCBI创建并维护的蛋白数据库，根据细菌、藻类和真核生物完整基因组的编码蛋白系统进化关系分类构建而成。通过比对可以将某个蛋白序列注释到某一个COG中，每一簇COG由直系同源序列构成，从而可以推测该序列的功能。
注：纵坐标是COG level 2分类（字母表示，共26种分类）；横坐标是注释到的CDS计数；颜色是COG level 1分类（四大类，分别是：细胞过程和信号传递、信息储存和加工、代谢和尚未明确）；柱子越长，属于该分类的预测基因越多。
4、Bin进化树
使用 PhyloPhlAn3软件将Bin与SGB.Jul20比对，以获取Bin之间的进化关系树和物种注释。图中的热图展示的是Bin相对丰度信息， 分支不同颜色表示门分类信息。
5、Bin圈图可视化
利用每个Bin（基于contig）的Prokka蛋白预测信息，功能区注释信息（含正负链、CDS、RNA类型等信息），以及GC content、GC skew的统计结果绘制Circos圈图，直观展示整个Bin的功能注释信息。
注：展示长度最长的20条contigs。从外到内，第一圈表示属于该bin的contigs，长度用刻度表示，单位为Mbp；第二圈用不同颜色区分contigs上的正链和负链；第三圈用不同颜色的三角标出tRNA, rRNA以及CDS(编码蛋白)的编码区；第四圈标注contigs分段（每1kb）GC含量，其中用不同颜色区分大于和小于所有contigs分段GC含量总平均值；第六圈标注contigs 分段(每1kb)GC skew值，大于和小于0用不同颜色区分。