菌株冻干粉复苏流程

一、安瓿瓶的打开方法

常见的用于保存菌种冻干粉的安瓿瓶有单层和双层两种，如下图1所示。

 图1 两种用于保存菌种冻干粉的安瓿瓶

 图2 单层安瓿瓶的打开方式      

    图3 双层安瓿瓶的打开方式

若双层安瓿瓶底部的干燥剂（蓝色硅胶珠）呈现无色或粉红色，则表明发生了泄漏，安瓿瓶内已不是真空状态，此时管内的菌种可能已经无法复苏。

如果不是立即对菌种进行复苏处理，则需要将安瓿瓶存放在2-8℃冰箱中。

二、菌种复苏实验流程

1、厌氧条件准备

根据菌株供应商提供的培养信息准备相应的固体和液体培养基，如果是厌氧菌株，准备厌氧仓条件。

2、菌株复苏

打开安瓿瓶，用0.5-1mL液体培养基重悬管内的菌体。若菌种为真菌，则建议将菌悬液转移至5-6mL无菌水中室温孵育数小时，孵育时间越长，菌株的活性越高。

若是进行液体培养，则将菌悬液全部取出，接种至5-6mL液体培养基中。若为固体平板培养，则需要将菌悬液按200μL/板的量接种至固体培养基平板上。

在合适的条件下进行培养，通常情况下会在2-5天内长菌，少数菌株会需要更长的培养时间。

3、菌种复苏后，对菌种进行保存，采用一代测序的方法进行菌种鉴定，来判断复苏出来的菌种是否符合预期。

4、根据老师要求，对复苏成功的菌株，进行扩大培养。

5、菌株扩培后，再次进行一代测序，来判断扩培菌株是否符合预期。

6、采用qPCR的方法，对扩培的菌株进行拷贝数的定量，根据rrnDB中菌株的拷贝数，进行菌株个数的转化。如果菌种水平没有拷贝数信息，那么根据更高一个级别进行转化。并稀释或浓缩到老师需要的菌株浓度。

7、根据需求对菌株进行分装，如果是厌氧菌株，则在厌氧仓中进行，并独立包装，加上吸氧剂抽真空保存。方便老师后继使用方便。

8、活菌的运输：如果菌株中加了冻存试剂，必须采用干冰运输，老师收到菌株后放在-80℃保存。如果老师指定要求是新鲜菌液，那么采用冰袋运输，老师收到菌株后放在4℃冰箱保存，并尽快使用掉，不宜在4℃冰箱中长期保存。

三、注意事项

1、针对厌氧菌株，以上操作都必须在无氧环境下进行。若在有氧环境下复苏厌氧菌，会导致菌株的活性会大幅下降，甚至复苏失败。

2、必须在符合相应的生物安全等级的实验室中，由接受过专业训练的人员进行以上所有操作。

3、操作过程中，需要全程做好防护措施。实验过程中产生的废弃物必须先灭菌，然后才能丢弃。

4、致病性的菌株公司不提供相应的服务。