靶基因高通量测序建库流程介绍

高通量测序简单介绍：

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation" sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

测序平台主要包括：454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing），等。现在二代测序的主流平台是illumina。

下面介绍靶基因的illumina平台建库流程：

 

一、基因组DNA的抽提

遗传信息绝大部分存在于基因组DNA中，所以建库的第一个步骤就是抽提基因组以获取纯度较高的DNA，用于后续实验，如PCR、测序、生物鉴定等。

目前针对不同类型的样本，都有对应的试剂盒。微基生物对于特殊类型的样本（皮肤样本等痕量微生物样本，或是组织等高宿主背景的样本等），也开发了自己的特有的抽提方法，以便增加基因组DNA的抽提效率。

二、基因组DNA的质控

基因组DNA采用琼脂糖凝胶电泳进行检测，是目前常用的一种检测方法。琼脂糖凝胶电泳法检测DNA，主要是基于分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。

三、设计并合成引物接头

illumina二代测序主要是针对靶基因进行测序。一般目的片段在450bp以内的可以采用PE250双端测序，测序结果可以进行拼接后分析。如果片段长度大于470bp，采用PE250测序后只能采用单端测序结果进行后继的生信分析。

根据illumina高通量测序要求，进行双向测序，设计目标区域和带有“5’接头-barcode-测序引物-特异引物-3’”的融合引物。并采用两步PCR扩增的方法构建文库。

                               

图来自illumina官方

最终PCR产物结构图：

 

四、PCR扩增

采用目的基因的特异引物，进行靶基因的扩增。常用的靶基因有16S V1-V2，16S V3-V4，16S V4-V5，ITS1，ITS2，18S V4，氮循环过程中的功能基因（nifH，amoA的AOA、AOB，nxrA，narG，nirK，nosZ，nirS，napA，norB等），碳循环过程中的功能基因（mcrA，pmoA，cbbL，cbbM等），硫循环过程中的功能基因（dsrA，dsrB等），丛枝菌根真菌AMF，放线菌，内生菌，弧菌，线虫等。

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的新方法，主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的循环。

PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷，常用的有柱式纯化和磁珠纯化。

 

五、PCR产物的纯化

六、PCR产物的定量

对每个纯化的PCR产物进行Real Time PCR定量，将所有纯化的PCR产物按照等摩尔比进行混合，主要是为了测序产出的数据量在每个样本中保持相对一致。

六、接头和barcode的添加

illumina测序的原理是PCR产物和测序仪的芯片上的oligo结合，而后采用边合成边测序的方法进行测序。所以我们的PCR产物还要添加测序需要的接头和barcode，以便正常测序。该步骤的实验主要采用PCR扩增的方法来完成。

文库构建完成，待库检后便可以上机测序。

实验中名词介绍：

1. illumina测序

采用illumina平台进行测序，该平台主要是基于边合成边测序的原理进行。可以一次产大量的DNA序列。常用的测序仪有miseq，novaseq。

illumina文库构建、测序、生信分析的流程如下图：

 

Illumina测序需要的接头序列信息为：

 

Illumina测序是如何进行的：

1. DNA：

脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic Acid，缩写为DNA）是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。

1. 琼脂糖凝胶电泳

是以琼脂糖为介质,对不同大小的DNA或RNA实现分离的一种电泳方法。

DNA分子在碱性环境中带负电荷，当放入电场中时,DNA分子向正极运动，不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时泳动率不同，从而分出不同的条带。DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，

琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分离范围参数：

凝胶浓度（%）	线性DNA长度（bp）
0.5	1000～30000
0.7	800～12000
1.0	500～10000
1.2	400～7000
1.5	200～3000
2.0	50～2000

1. PCR：

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。PCR反应的底物有：模板、taq酶、引物、buffer。

1. 引物：

引物是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的，一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以氢键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

1. Taq酶：

Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。PCR循环包括变性（90 °C左右）、退火（55°C左右）、延伸（70°C左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷。

1. 实时荧光定量PCR技术：

实时荧光定量PCR技术（Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction简称Real Time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA拷贝数最敏感、最准确的方法。