超级增强子的先驱者Richard A. Young与JQ1/iBET研发者Bradner J.E.这两位科学家曾预言超级增强子具有广阔的研发前景和价值，必将成为下一个药物研发的黄金靶点，有望开发一种精确影响基因调控元件的药物。这两位科学家也因此联手成立Syros Pharmaceuticals(SYRS)公司，研发针对超级增强子的抗癌药。经过了9年的发展，如今以超级增强子为靶点的肿瘤治疗用小分子抑制剂已进入临床研究阶段。所以针对2013年出现的研究热点-超级增强子，本文从超级增强子的研究背景，研究意义，发病机制，研究方法概述如何通过超级增强子来丰富基因调控机制研究。
研究背景和研究意义
01
普通增强子（Typical Enhancer, TE)
增强子(enhancer)，是DNA上一段可与蛋白质（反式作用因子，trans-acting factor）结合的区域，可以被转录因子等蛋白结合从而激活基因转录。1981年，增强子首次被描述为猿猴病毒40 (SV40)基因组中一个72bp的重复序列，可以使报告基因的异位表达增加约200倍。1983年，在哺乳动物的小鼠免疫球蛋白重链基因中发现了增强子随后，在各种细胞和组织中有不同的增强子被报道[1]。
增强子可能位于基因上游，也可能位于下游。且不一定接近所要作用的基因，甚至不一定与基因位于同一染色体。这是因为染色质的缠绕结构，使序列上相隔很远的位置也有机会相互接触[2]。它可以通过顺式或反式相互作用的方式对发育过程中的时空基因表达进行正向调控[3]。
增强子具有以下特征：
1
增强子DNA 序列处于染色体疏松的区域，与核小体中组蛋白的修饰，转录因子的结合有关。
2
增强子活性与其DNA 序列结合的组蛋白H3 的第4 位赖氨酸单甲基化(H3K4me1)和 第27 位赖氨酸乙酰化(H3K27ac)修饰程度成正相关[5]。
3
增强子发挥功能需要增强子区域和启动子的区域的直接相互作用，形成三维环状结构(3D-loop)。增强子和启动子的相互作用由多种蛋白介导，如Mediator 复合体、Cohesin 等[4,5]。
真核生物细胞中，染色质复合体结构能以超螺旋折叠存在，因此即使增强子与基因相隔很长的核苷酸序列，但在空间上两者相近，这使得增强子结合转录因子及RNA多聚酶II的可能性增加。增强子可以在被它调控基因的上游或下游，且增强子不一定位于转录起始位点附近才能调控基因转录，已发现有些增强子距离可达几十万碱基。增强子通过与激活蛋白的结合影响PolII对启动子的结合作用。在内含子中发现有增强子，增强子的方向颠倒后并不影响它的功能，而且增强子可被切除并插入到染色体的其他位置，仍然影响基因转录。所以虽然内含子并不转录，但其多态性会起转录调控作用。
02
超级增强子（Super enhancer, SE）
超级增强子是一类具有超强转录激活特性的顺式调控元件，2013年由美国Whitehead生物医学研究所（Whitehead Institute for Biomedical Research）学者Richard A. Young首次提出。超级增强子比普通增强子具有更高的转录激活相关组蛋白修饰（H3K27ac、H3Kme1等）、Mediator复合体和 Bromodomain containing 4 蛋白(BRD4，与组蛋白乙酰化修饰位点结合)及转录因子的富集密度[6]，超级增强子区域跨度范围通常可达 8-20 Kb，远高于普通增强子的200-300 bp跨度范围。结合上述特点，超级增强子具有强大的调控功能。
超级增强子具有以下特点：
1
超级增强子具有高密度H3K27ac 和H3K4me1 修饰，同时与Mediator复合体和 Bromodomain containing 4 蛋白(BRD4，与组蛋白乙酰化修饰位点结合)的结合。
2
超级增强子比普通增强子结合的转录因子以及与转录活性相关的组蛋白修饰高很多。
3
超级增强子比普通增强子调控的基因表达水平高很多。
4
超级增强子比普通增强子调控的基因表达水平高很多。
5
超级增强子具有组织特异性。
近年来研究发现，超级增强子在癌症发生、细胞分化、免疫应答等重要生物学过程中发挥着重要调控功能，其所调控的基因包含原癌及抑癌基因、细胞身份决定基因、炎症通路关键基因等[7- 10]。由于许多肿瘤细胞关键致癌基因由超级增强子驱动，超级增强子有潜力成为理想的抗癌靶点，成为世界科技前沿的研究热点。
03
超级增强子与疾病
Richard A. Young最早在多发性骨髓瘤细胞中发现超级增强子的区域募集了大量Mediator复合体和BRD4，并证明MYC、IRF4、PRDM1、XBP1受到超级增强子调控，促进多发性骨髓瘤的发生和发展 [11]。目前，超级增强子与多种疾病发生发展有关，其中被报道的包括了不同类型的肿瘤，比如大B细胞淋巴瘤、T细胞急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、默克尔细胞癌、小细胞肺癌、卵巢癌、鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、上皮癌、黑色素瘤、乳腺癌和结肠癌等[12]。研究显示，超级增强子在肿瘤细胞中调控关键的癌基因，从而对肿瘤生成和肿瘤特性维持起到关键作用。同时，超级增强子能够富集肿瘤细胞依赖的信号通路的转录因子，比如结肠癌细胞中，超级增强子富集了Wnt 信号通路相关的的转录因子 4 (tra-nscription factor 4, TCF4)，通过激活或者抑制 Wnt 信号通路，控制超级增强子调控的基因转录，从而引起Wnt信号通路异常，导致结直肠癌的发生发展[13,14]。在雌激素受体 （estrogen receptor, ER）阳性的乳腺癌细胞中，乳腺癌相关的超级增强子区域募集了大量的ERα; 而在三阴性乳腺癌细胞（缺少类固醇激素的表达）中，乳腺癌相关的超级增强子区域富集了完全不同的转录因子 [15]。所以，超级增强子具有组织特异性，通过不同的转录因子对不同肿瘤细胞的恶性转化具有促进作用。相反的，肿瘤细胞的信号通路可以调控超级增强子的活性。Licht 等人发现 Ras-Erk 活性与超级增强子的活性密切相关：抑制Ras蛋白的活性会导致H3K27ac消失，超级增强子活性下降、降低相关基因转录；激活Ras可以增强调控癌基因的超级增强子活性 [16]。有趣的是，促癌信号通路还可以通过操纵转录机器调节超级增强子的活性，比如肝癌中YAP（Yes associated protein）蛋白结合到超级增强子上，从而激活超级增强子募集 Mediator和CDK9（细胞周期素依赖性激酶9）使暂停的Pol II进入延伸状态，促进癌基因转录 [17]。综上，癌基因信号通路能够通过超级增强子维持肿瘤细胞特性的基因转录表达。除肿瘤外，超级增强子异常相关的疾病还有：阿尔兹海默症、类风湿关节炎、克罗恩病。这些免疫类疾病主要是由于T细胞产生了突变，且突变位点大量分布于超级增强子区域内[18]。
超级增强子研究工具
01
ChIP-seq/CUT&TAG鉴定（超级）增强子
通过增强子转录活性标记分子的ChIP-seq或CUT&TAG，鉴定超级增强子，这些分子包括辅因子（如Mediator和cohesin）、组蛋白修饰标记（如H3K27ac和H3K4me1）、染色质修饰分子（如p300）等。
通过ChIP-Seq分析这些增强子转录活性标记分子在基因组上的富集情况，确定活性增强子位点。之后再对所有活性增强子进行分析，鉴定得到超级增强子。通过与转录组测序数据进行关联分析，可发现超级增强子所调控的靶基因。
1.1
技术应用
a
发现致病驱动基因
b
找到参与基因调控的转录因子
c
开发基于超级增强子复杂性疾病的精准诊断和药物开发
02
ATAC-seq鉴定（超级）增强子
染色质开放性是指真核生物染色质DNA和转录因子等蛋白能否结合的开放程度，这一特性反映了染色质转录活跃程度，结合其他DNA修饰（如甲基化）信息，特定条件下的染色质开放性变化可以提供大量的基因表达调控信息，为各种蛋白结合新位点的发现指明方向。还可分析初生组织和细胞（如胰岛β细胞）、临床患者样本，基于染色质开放性特征对患者和样品进行分类。ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing） 是2013年由斯坦福大学的研究人员开发的用于研究染色质可及性（通常也理解为染色质的开放性）的方法，原理是通过转座酶Tn5容易结合在开放染色质的特性，然后对Tn5酶捕获到的DNA序列进行测序。ATAC-Seq由于所需细胞量少，可以在全基因组范围内检测染色质的开放状态，已经成为研究染色质开放性的首选技术方法[19]。对于未知表观遗传是否在细胞系统的应答发挥作用的情况，或者不清楚哪种组蛋白修饰、转录因子是最重要的, 或者细胞数量很少的情况前提下，ATAC-seq是比ChIP-seq更适合的一种研究技术。
2.1
技术应用
a
判断课题是否涉及表观遗传调控机制
b
找到参与基因调控的转录因子
c
鉴定转录因子调控的靶基因和功能元件
d
鉴定活性超级增强子
e
通过开放的染色质图谱，可以更好地了解药物或疾病的基因调控和细胞应答机制
03
KAS-seq鉴定（超级）增强子
KAS-Seq（kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing）是芝加哥大学何川教授团队于2020年4月发表在 Nature Methods 上的全新方法。KAS-seq 利用N3-kethoxal可在短时间内与细胞DNA单链状态的鸟嘌呤特异性结合的特点，在全基因组范围内快速和灵敏地检测由转录或其它过程产生的ssDNA，例如正在进行转录或复制活动的DNA，进而可快速准确地分析转录动态变化和增强子活性，因此该技术可应用于研究细胞特定状态下的转录调控。相较于Pol II ChIPseq，该技术的显著优势是样本投入起始量少。相比于ATAC-seq的Tn5特异性结合序列，KAS-seq有着更广谱的转录活性识别[20]。
3.1
技术应用
a
判断课题是否涉及表观遗传调控机制
b
找到参与基因转录的转录因子
c
鉴定转录因子调控的靶基因及其转录活性
d
鉴定活跃的超级增强子
参考文献
[1] Blackwood EM, Kadonaga JT. Going the distance: acurrent view of enhancer action. Science, 1998,281(5373):60–63.
[2] Bulger M, Groudine M. Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers. Cell, 2011,144(3): 327–339.
[3] Levine M. Transcriptional enhancers in animal development and evolution. Curr Biol, 2010, 20(17): R754–763.
[4] Sengupta S, George RE. Super-enhancer-driven transcriptional dependencies in cancer. Trends Cancer, 2017,3(4): 269–281.
[5] Ing-Simmons E, Seitan VC, Faure AJ, Flicek P, Carroll T, Dekker J, Fisher AG, Lenhard B, Merkenschlager M.Spatial enhancer clustering and regulation of enhancerproximal genes by cohesin. Genome Res, 2015, 25(4):504–513.
[6] Whyte W A, Orlando D A, Hnisz D, et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell, 153(2): 307-19
[7] Tang F, Yang Z, Tan Y, et al. Super-enhancer function and its application in cancer targeted therapy. NPJ Precis Oncol, 4: 2.
[8] Sciumè G, Mikami Y, Jankovic D, et al. Rapid Enhancer Remodeling and Transcription Factor Repurposing Enable High Magnitude Gene Induction upon Acute Activation of NK Cells. Immunity, 53(4): 745-58.e4.
[9] Hnisz D, Schuijers J, Lin CY, Weintraub AS, Abraham BJ, Lee TI, Bradner JE, Young RA. Convergence ofdevelopmental and oncogenic signaling pathways at transcriptional super-enhancers. Mol Cell, 2015, 58(2):362–370.
[10] van Groningen T, Koster J, Valentijn L J, et al. Neuroblastoma is composed of two super-enhancer-associated differentia tion states. Nat Genet, 49(8): 1261-6.
[11] Lovén J, Hoke HA, Lin CY, Lau A, Orlando DA, Vakoc CR, Bradner JE, Lee TI, Young RA. Selective inhibition oftumor oncogenes by disruption of super-enhancers. Cell, 2013, 153(2): 320–334.
[12] 吴志强, 米泽云. 超级增强子在肿瘤研究中的进展[J]. 遗传, 2018, 41(1): 41-51.
[13] Hnisz D, Schuijers J, Lin CY, Weintraub AS, Abraham BJ, Lee TI, Bradner JE, Young RA. Convergence ofdevelopmental and oncogenic signaling pathways at transcriptional super-enhancers. Mol Cell, 2015, 58(2):362–370.
[14] Super-enhancers facilitate gene regulation by signaling pathways. Cancer Discov, 2015, 5(5): OF11.
[15] Wang Y, Zhang T, Kwiatkowski N, Abraham BJ, Lee TI, Xie S, Yuzugullu H, Von T, Li H, Lin Z, Stover DG, LimE, Wang ZC, Iglehart JD, Young RA, Gray NS, Zhao JJ. CDK7-dependent transcriptional addiction in triplenegativebreast cancer. Cell, 2015, 163(1): 174–186.
[16] Nabet B, P óB, Reyes JM, Shieh K, Lin CY, Will CM, Popovic R, Ezponda T, Bradner JE, Golden AA, Licht JD.Deregulation of the ras-erk signaling axis modulates the enhancer landscape. Cell Rep, 2015, 12(8):1300–1313.
[17] Adelman K, Lis JT. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nat RevGenet, 2012, 13(10): 720–731.
[18] Vahedi G, Kanno Y, Furumoto Y, et al. Super-enhancers delineate diSEaSE- associated regulatory nodes in Tcells[J].Nature, 2015, 520(7548):558-562.
[19] Buenrostro J D, Giresi P G, Zaba L C, et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic pr ofiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome positio n. Nature methods, 10(12): 1213-8.
[20] Wu T, Lyu R, You Q, et al. Author Correction: Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activity in situ. Nat Methods, 2020, 17(7): 749.