CUT&Tag技术势必将引领蛋白质—DNA互作新革命！【百迈客生物】

染色质免疫共沉淀测序技术（Chromatin Immunopreciptation with Sequencing，ChIP-Seq），作为传统的研究细胞内蛋白质与DNA互作的重要工具，技术成熟，已被广泛应用于动植物的表观遗传学研究。但是由于ChIP的交联作用/免疫共沉淀的局限性（如：需要大量细胞，实验重复性差，低信号、高背景等），往往导致大量的精力投入却得不到预期的结果。CUT&Tag解除了传统ChIP-Seq的众多限制因素，势必将引领蛋白质—DNA互作新革命。

CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技术首次应用于哺乳动物细胞，并于2019年4月29日《Nature Communications》上公布[1]。

什么是CUT&Tag技术？

CUT&Tag是一种全新的研究DNA与蛋白质互作的技术，可以替代传统的ChIP-Seq，主要用于研究目标蛋白在染色质上的定位，在表观遗传学研究等领域至关重要。

图1 CUT&Tag的基本原理

CUT&Tag使用Protein A与Tn5转座酶的融合蛋白（ChiTag），在抗体的引导下，Protein A与染色质上的目的组蛋白修饰标记、转录因子或染色质调控蛋白结合，连带的Tn5转座酶对目的蛋白附近的DNA序列进行切割，并将测序接头连接到切割片段的两端（图1），并释放到细胞外，PCR扩增后直接用于高通量测序。

与ChIP-Seq相比，CUT&Tag具有哪些优势？

图2 CUT&Tag与ChIP-Seq实验流程对比[2]

（1）无需交联、超声打断等步骤，节约时间；

（2）不受ChIP交联引起的表位遮蔽影响；

（3）高分辨率和低背景信号（这是由于转座酶原位激活切割染色质）；（4）转座酶切割片段两边序列能同时加上测序接头，为PCR扩增做准备；

（5）细胞需求量从10,000个降至60个甚至单细胞；

（6）需要的测序深度低，节省成本。

CUT&Tag在植物上很难成功？

植物细胞细胞壁、大液泡及一些次生代谢产物的存在，使得这项技术在植物中的应用多具挑战性。但是，Tao等于2020年8月31日在《Plant Methods》上发表CUT&Tag和ChIP-Seq技术在棉花应用的比较[2]，种种结果表明，CUT&Tag技术能够在植物中成功应用，且所得结果明显优于ChIP-Seq。

H3K4me3是一个通用的基因表达活性标记。Tao等用棉花叶片为材料，以H3K4me3抗体设置了2个生物学重复，以IgG抗体作为对照用于CUT&Tag实验；用H3K4me3抗体做一个ChIP，不加H3K4me3抗体的ChIP mock作为对照。分别从以下几点对CUT&Tag和ChIP-Seq进行比较。

一、 重复性

对CUT&Tag和ChIP数据进行相关性分析，发现CUT&Tag的两个生物学重复（CUT&Tag_H3K4me3_rep1和CUT&Tag_H3K4me3_rep2）与对照CUT&Tag_IgG相关性非常低（r=0.01，Pearson’s correlation），表明CUT&Tag实验组和对照组（背景噪音）存在显著性差异（图3，a），然而，ChIP_H3K4me3实验组与ChIP_mock具有很高的相关性（r=0.89，Pearson’s correlation），这表明，ChIP分析中信号-噪音比例很高（图3，a），而CUT&Tag实验组的两个生物学重复相关性近乎完美（r=0.97，Pearson’s correlation），说明不同的生物学重复之间重复性非常好（图3，b）。

图3 CUT&Tag与ChIP样品的相关性分析。

二、分辨率（测序深度）

为了分析CUT&Tag和ChIP的数据的信号分辨率，每个样品随机选取6M-24M的clean data，分别call peak后发现CUT&Tag实验组的两个生物学重复在clean data为6M时，peaks数目分别为42,367和46,779，ChIP仅有18,024条，当ChIP的 clean data达到24M时，peaks数才达到40,859条（表1），这意味着CUT&Tag 6M clean data产生的信号分辨率相当于ChIP 24M clean data产生的。这些peaks中的25,597（54.7-62.6%）个是CUT&Tag与ChIP共有的，两个CUT&Tag生物学重复的共有peaks为37,168（79.5-87.7%；图3，c），这也说明CUT&Tag的高重现性。

表1 相同测序深度下CUT&Tag及ChIP产生的 peaks数及FRiP值

三、 信噪比

FRiP（fraction of reads in peaks）values calculated the ratio of mapped reads that fall into peaks among all mapped reads. FRiP值越高，信噪比越高，结果也越可靠。结果表明CUT&Tag产生的信噪比较高（FRiP=0.7；表1）。然而，从H3K4me3信号热图上可以看出，在整个gene body区域CUT&Tag的信号比ChIP-Seq更强（图4，a）。从相关性分析的结果可以看出，基因附近的peaks在CUT&Tag两个生物学重复之间相关性很高（r=0.94，pearson’s correlation；图4，b），CUT&Tag和ChIP之间的相关性也较高（r=0.71，pearson’s correlation；图4，c）。

图4 CUT&Tag和ChIP分析蛋白质编码基因附近的H3K4me3信号

四、灵敏性

与热图显示的强度一致，IGV截图表明CUT&Tag信号在分辨率和灵敏度上的表现优于ChIP（图5，a），尤其在表达量相对低的基因中表现尤为明显（如GB_A11G1394, GB_D10G1774, 和 GB_A13G1872；图5，b）

图5 有代表性的H3K4me4信号的IGV截图

综上所述，Tao等对Steven Henikoff团队研发的CUT&Tag技术进行改进，打破植物细胞壁、大液泡和次生代谢产物的壁垒，使其能够广泛应用于植物染色质的释放。CUT&Tag与传统的ChIP-Seq相比，操作简单，所需时间短，且所需细胞少，能产生高分辨率信号，且背景噪音低，这些优点奠定了不久的将来该技术在表观遗传学研究中的“流量新秀”的地位。

参考文献：

[1]  Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communication. 2019;10(1):1930. https://doi.org/10.1038/s41467-019-09982-5

[2]  Xiaoyuan Tao, Feng SL, Zhao T and Guan XY. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 2020;16(1). https://doi.org/10.1186/s13007-020-00664-8