TREM2(high)巨噬细胞和γδT细胞的基因表达特征预测免疫治疗反应

题目：A gene expression signature of TREM2hi macrophages and γδ T cells predicts immunotherapy response
发表期刊：Nature communications(IF:16.806)
发表年份：2020-10-08

摘要

背景：确定免疫检查点疗法（ICT）耐药抵抗相关因素仍然具有挑战性。大多数癌症患者对ICT没有反应，并且生物标记物的预测能力有限。
方法：分析了接受ICT治疗的黑色素瘤样本的单细胞RNA测序公共数据集和4个转录组数据集。
结果：确定了在ICT无应答反应的样本中，有高表达TREM2的巨噬细胞亚群和gammadelta T细胞亚群。此外，无应答者的B细胞亚群比例显著降低。在其他公共数据集中，得到验证。并最终建立了一个ImmuneCells.Sig，可以较准确的预测ICT反应。

分析方法

数据来源：黑色素瘤单细胞数据来自GSE120575，GSE115978。膀胱癌单细胞数据来自GSE123813。还有四个黑色素瘤转录组数据来自GSE91061, ENA project PRJEB23709, dbGaP和phs000452.v3.p1。其中GSE120575作为训练集，其他作为验证集。
Seurat分析流程： GSE120575总共16291个单细胞进行聚类，包括有应答组（17例Response样本，5564个细胞）和进展/无应答者（ 31例子Non Response样本，10727个细胞）。t-SNE和UMAP进行可视化。
转录组组数据和验证：用到的R包是DESeq2，对应AUC的计算用的是cancerclass包。
通路分析：IPA software， GSVA，和GSEA。

结果：

1.免疫细胞群与ICT反应的关联。

总共得到16,291个细胞，分为23个亚群，经注释后，得到10个主要的免疫细胞亚群。 : CD8+ T cells (CD3+CD8A+CD4−); CD4+ T cells (CD3+CD8A−CD4+); Regulatory T cells (Tregs) (FOXP3+);MKI67hi Lymph. (MKI67+,); B cells (CD19+); Plasma cells (MZB1+,); NK cells(NCR1+NCAM1+,); γδ T cells (i.e., Tgd cells,CD3+CD8A−CD4−); Macrophages (MARCO+MERTK+,); and Dendritic cells (FCER1A+)

Figure 1a-b

比较了对ICB无应答样本跟应答样本中23个免疫细胞群的比例变化。其中一些免疫细胞亚群在ICT响应者（R）和非响应者（NR）中的数量上存在差异包括clusters6、9、12、13、14、17、19、21、22. 其中有3个亚群的变化最明显(clusters12、21和22)。

Figure 1C-D

2.TREM2hi 巨噬细胞可能导致了ICT耐药。

cluster6、12和23中的巨噬细胞群在R组和NR组之间存在差异。其中，在NR组，cluster6高了2.4倍，cluster23低了2.1倍。但是cluster12巨噬细胞增加了15.1倍（NR4.88% vs R 0.32%）。这提示了cluster12可能参与了ICT耐药。对cluster6,12和23进行差异分析。结果显示，Cluster 12 高度表达TREM2基因，将这个细胞群命名为TREM2hiMφ (Mφ = macrophages)。在NR中，TREM2hi Mφ亚群高表达SPP1, RNASE1, MT1G, SEPP1, FOLR2, NUPR1, KLHDC8B, CCL18, MMP12, APOC2 和补体通路相关基因 C3, C1QA, C1QB, and C1QC。Cluster 6 (61.6% of all Mφ)高度表达免疫抑制蛋白 IDO1和炎症基因 (FCER1A, S100A12, APOBEC3A, SELL, 和CXCL10)，将cluster6命名为Inflammatory Mφ。cluster23高度表达免疫调节相关基因LCK, TIGIT, PTPRCAP, KLRK1, LAT, IL32, IFITM1 和CCL5，因此将它命名为Immunoregulatory related Mφ。

Figure 2a-b

3.TREM2hi巨噬细胞中显著丰富的通路。

接着是探索3类巨噬细胞亚群功能异质性与ICT反应结果相关性。他们发现每个巨噬细胞亚群都有特定的显著富集通路。Inflammatory Mφ（cluster6）富集在了FCERI信号以及和FCERI介导的通路（NF-kappaB activation, Ca2+ mobilization and MAPK activation）。Immunoregulatory related Mφ（cluster23）富集在了调节SLITs and ROBOs表达以及 ROBO receptors通路上。TREM2hi Mφ（cluster12），在NR中上调的比例最大，富集在补体激活相关通路（补体级联及其机制调节、补体的初始触发、C4和C2活化剂和经典抗体介导的补体激活）。

Supplementary Fig. 6

在TREM2hi Mφ中补体系统基因高度表达，包括补体C1q链（C1QA、C1QB和C1QC），C2和C3。这些基因在cluster 6和23中，要么不表达，要么处于非常低的水平。TREM2hi巨噬细胞也过度表达M2极化基因（MMP14、CD276、FN1、MRC1、CCL13，CCL18，LYVE1，PDCD1LG2（PD-L2），MMP9，TGFB2，ARG2）。因此，TREM2hi巨噬细胞可能在功能上接近M2型巨噬细胞，并可阻断巨噬细胞的抗肿瘤活性，有助于病人对ICT耐药。

4.TREM2hi巨噬细胞特征的验证

基于在TREM2hi巨噬细胞过度表达基因，开发了40个基因来代表TREM2hi巨噬细胞的特征，包括与TREM2表达（补体系统或M2极化）高度相关，以及其他过度表达基因。为了测试TREM2hi巨噬细胞特征是否与ICT耐药性相关，他们还分析了另外两个公开的基因表达数据集，同样也是接受了免疫治疗患者。ICT无应答者的TREM2hi巨噬细胞特征（40个基因）的GSVA得分显著高于应答者，表明无应答者的黑色素瘤有更高比例的TREM2hi巨噬细胞。对40个基因进行GSVA分析，验证了该基因集的特异性。

Supplementary Figure 7

5.γδT细胞和B细胞亚群与ICT反应的关系

他们还鉴定了两组γδT细胞（n=927；clusters8)。细胞数量最多的cluster8在R和NR中，无显著差异。然而，一个罕见的γδT细胞类型（cluster21群，n=146），NR组比R组高了12.1倍（NR组为1.31%，R组为0.11%）。这表明，cluster21γδT细胞（命为Tgd_c21）可能导致ICT耐药。对Tgd_c21和Tgd_c8进行差异分析，差异最明显基因为RRM2，BIRC5、SPC24、UBE2C和CDCA5。GSEA分析提示与癌症相关的多种通路改变可能参与了Tgd_c21细胞对ICT耐药机制，包括 ligand-receptor binding capacity, IFNα and IFNβ signaling, IFN-γ response, and immunoregulatory interactions 通路的下调。因此，Tgd_c21亚群可能代表一个以前未识别的细胞类型，其能损害抗肿瘤免疫功能。

还对B细胞与CIT的相关性进行分析。在所有4个B细胞亚群中（13、14、17和22，NR组的细胞数量较少，这表明肿瘤相关B细胞通常与良好的ICT响应率相关。与R组对比，NR中cluster22亚群（命名为B_c22）下调了9.3倍。对B_c22与其他B细胞亚群进行差异分析，确定了前20个差异基因。GSEA通路分析显示B_c22细胞中致癌信号通路显著下调，包括Toll receptor signaling/cascades, NOTCH1, MAPK, and MYC signaling pathways。在R组中，ICT中B_c22细胞的显著富集，有助于降低肿瘤微环境（TME）中的致癌信号通路，增强ICT的抗肿瘤功能。

Figure3

6.在其他scRNA数据集验证

下载重新分析了黑色素瘤接受免疫治疗的单细胞数据。该数据集没有γδT细胞数据。他们发现存在类似的巨噬细胞和B细胞亚群，其特征类似于鉴定的TREM2hi巨噬细胞和B_c22 B细胞（补充图8a，B）。具体而言，“Mac_c1”巨噬细胞亚群过度表达TREM2hi巨噬细胞marker，如TREM2、SPP1、RNASE1、MT1G、SEPP1、FOLR2、KLHDC8B、CCL18、MMP12、，APOC2、C3、C1QA、C1QB和C1QC；）。“B_s1”B细胞亚群过度表达B_c22 B细胞marker（ABCA6、LEF1、FGR、IL2RA、ITGAX和IL7）。
在这个数据集中，与对照相比，免疫治疗无应答者中，Mac_c1巨噬细胞亚群中TREM2hi巨噬细胞marker基因总体水平显著升高，B_s1 B细胞亚群中B_c22 Bmarker基因总体水平显著降低。这些结果支持与前一个数据集的研究结果，即TREM2hi巨噬细胞和B_c22 B细胞在免疫治疗反应中变化趋势一致。

Supplementary Figure 8

Supplementary Figure 8

Supplementary Figure 8

此外，还下载分析了基底细胞癌basal cell carcinoma (BCC)接受抗PD1治疗前后的单细胞数据集。先确定了与TREM2hi巨噬细胞和B_c22 B细胞表达特征相似的巨噬细胞和B细胞亚群。确定了Mac_s2巨噬细胞亚群过度表达TREM2hi巨噬细胞标记基因（TREM2，FOLR2、MMP12、C1QA、C1QB和C1Qc）；B_sc2 B细胞亚群过度表达B_c22 B细胞标记基因（TRAC、IL2RA、ITGB1、ZBTB32、TRAF1和
CCND2）。并验证Mac_s2细胞中TREM2hi巨噬细胞和B_sc2中B_c22B细胞marker整体变化水平。
与治疗前BCC样本相比，抗PD-1治疗后，Mac_s2细胞中TREM2hi巨噬细胞marker整体水平下调，而B_sc2中B_c22B细胞marker整体水平显著上调。这些发现表明，在免疫治疗反应的背景下，黑色素瘤和基底细胞癌中的特征性基因表达发生类似的改变。

Supplementary Figure 9

7.建立 ICT outcome signature.

由于TREM2HI Mφ、Tgd_c21和B_c22群体在ICT无应答者和应答者之间表现出最大的数量差异，他们假设这些群体特征基因的表达可以预测ICT结果。为了探索这一假设，他们使用R package cancerclass，开发了一个基于scRNA-seq数据集和转录组数据集GSE782209 ICT响应特征签名。该signature具有显著的预测价值。具体来说，对于GSE78220数据集（N=28，NR：R:=13：15），AUC值为0.98。在GSE78220中，28个样本均来自治疗前样本。因为这个signature主要富集在TREM2hi Mφ, Tgd_c21, B_c22 immune cell subpopulations中，因此命名为ImmuneCells.Sig。在GSE91061，PRJEB23709和MGSP中验证ImmuneCells.Sig，其AUC分别是0.96，0.86和0.88。

Figure. 4

进一步评估ImmuneCells.Sig与其他12个ICT signature 的差异。结果表明，ImmuneCells.Sig是预测ICT反应的最佳特征

Fe 5

结论

该研究确定了一个ImmuneCells.Sig，这个基因集主要在TREM2hi巨噬细胞、Tgd_c21和B_c22亚群高表达。在4个独立的数据集中，ImmuneCells.Sig对ICT的预测能力优于其他现有的模型。该研究对这些免疫细胞群的研究为提高癌症免疫治疗的疗效和更好地理解ICT耐药性的机制提供了新的见解。