2021-09-22

Nature | 腺泡克隆扩张假说解释胰腺癌的发生

原创 骄阳似我 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：49.962

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亮点：

1. 利用内源性端粒酶逆转录酶（Tert）基因座的谱系追踪，本文发现了一个罕见的分布于外分泌区的胰腺腺泡细胞Tert阳性亚群。在体内平衡期间，这些大腿间腺泡细胞通过形成扩张的腺泡细胞克隆来更新胰腺，而随机标记的腺泡细胞不形成这些克隆。

2. 突变体Kras在大腿间腺泡细胞中的特异性表达通过上调Ras–MAPK信号和激活下游激酶ERK（磷酸化ERK），加速腺泡克隆的形成并导致向导管浸润前胰腺上皮内肿瘤的转分化。在切除的人类胰腺肿瘤中发现磷酸化ERK阳性腺泡细胞的病变很常见，并且经常包含激活KRAS突变，这表明这些腺泡区域代表了早期的癌症前体病变。

3. 以上这些数据支持了一个腺泡克隆扩张假说模型，在该模型中，罕见的大腿间腺泡细胞可能维持KRAS突变，驱动腺泡细胞扩张，并产生一个启动胰腺肿瘤发生的异常细胞区域。

胰腺导管腺癌（PDAC）是全世界癌症死亡的主要原因之一。对人类组织和小鼠模型的研究表明，对于许多癌症，干细胞维持早期突变，从而推动肿瘤的发展。然而，对于胰腺而言，细胞更新和PDAC启动的潜在机制仍未解决。PDAC来源于胰腺外分泌内的上皮细胞，包括分泌腺泡细胞和导管细胞。胰腺外分泌细胞受到谱系限制，因为新生成的腺泡细胞和导管细胞分别主要来源于腺泡细胞和导管细胞室。在腺泡细胞谱系中，罕见的腺泡细胞亚群被认为是腺泡更新的燃料。PDAC癌细胞表现出导管的命运，PDAC通常来源于具有导管特征的侵袭前胰腺上皮内肿瘤（PanIN）病变。尽管有这些导管特征，使用小鼠模型进行的遗传学研究支持腺泡区中PDAC和PanINs的起源。相比之下，使用小鼠和人类类器官的研究表明，在原位移植后，导管类器官的遗传操作产生PanIN损伤和PDAC。KRAS的突变激活是驱动PDAC和PanIN发展的主要途径，在95%的侵袭性PDAC和68–90%的PANIS中发现KRAS突变。KRAS突变足以驱动PanIN的形成，而肿瘤抑制基因的缺失则是进展到PDAC所必需的。

端粒酶通过向端粒（保护染色体末端的核蛋白结构）添加DNA重复序列，在干细胞自我更新和癌症发生中发挥重要作用。端粒酶水平不足会导致端粒逐渐缩短，最终导致衰老和危机反应。在许多组织中，基于Tert21的转录控制，端粒酶的表达仅限于干细胞和祖细胞群体。在胰腺中，端粒酶在侵袭性PDAC中普遍上调，TERT基因座的多态性与PDAC风险增加有关，但在正常胰腺中TERT的表达模式尚未探讨。

近期，在Nature杂志上发表了一篇名为“Acinar cell clonal expansion in pancreas homeostasis and carcinogenesis”的文章，这篇文章的数据支持了一个模型，在该模型中，罕见的大腿间腺泡细胞可能维持KRAS突变，驱动腺泡细胞扩张，并产生一个启动胰腺肿瘤发生的异常细胞区域。

为了鉴定表达Tert的细胞并了解活体胰腺中细胞更新的机制，本文对表达内源性Tert区调节的CreERT2重组酶的小鼠菌株进行了谱系追踪。将TertCreERT2/+小鼠与Rosa26LSL TOMATO/+报告菌株杂交，通过表达荧光TOMATO蛋白产生Cre依赖性永久性细胞标记。向Rosa26LSL TOMATO/+（Tert CreER）小鼠注射单剂量他莫昔芬（5 mg），并在10天后进行分析，以标记活性表达Tert的细胞。发现分布在胰腺中的一个罕见的细胞亚群表达TOMATO。双重免疫染色显示，在外分泌胰腺内，TOMATO阳性细胞仅为淀粉酶阳性腺泡细胞，而未检测到表达TOMATO的导管细胞。确定Tert mRNA是否在罕见的TOMATO阳性细胞、TOMATO+和TOMATO中富集,使用单分子RNA荧光原位杂交（FISH）分析来自Tert CreER小鼠的腺泡细胞和通过荧光激活细胞分选（FACS）分选的野生型小鼠的大量腺泡细胞的Tert mRNA表达。mRNA FISH的定量分析表明，绝大多数的腺泡细胞为中下型，而罕见的亚群（1.9%）为中下型。TOMATO−Tert CreER小鼠的细胞与野生型小鼠的体细胞非常相似。相比之下，TOMATO+细胞高度富集大腿间细胞。这些数据确定了一种罕见的腺泡细胞亚群，其Tert mRNA水平升高，分布于胰腺外分泌部。图1|鉴定Tert表达升高的腺泡细胞亚群。

为了确定在体内平衡过程中大腿间腺泡细胞是否重新填充胰腺，在注射他莫昔芬6-24个月后分析的成年Tert CreER小鼠中进行了长期追踪实验。在此期间，随着单细胞克隆数量的减少，平均克隆大小逐渐增加，而多细胞克隆数量增加。这些数据表明，大腿间腺泡细胞重新填充外分泌胰腺，并在长达两年的时间内产生逐渐扩大的克隆。为了比较大腿间腺泡细胞和随机腺泡细胞的克隆形成能力，用0.05 mg他莫昔芬治疗Ptf1a CreER小鼠，然后追踪10天、6个月和12个月。与大腿间腺泡细胞的克隆形成性相反，随机标记的腺泡细胞即使经过12个月的追踪也没有形成克隆。与Ptf1a CreER小鼠中随机标记的腺泡细胞相比，在第10天和第30天，大腿间细胞显示加速克隆形成。综上所述，这些数据表明大腿间腺泡细胞通过形成越来越多由大腿间腺泡细胞组成的克隆来更新腺泡细胞室，并且这种自我更新的能力在一般腺泡细胞群体中更为有限。图2|大腿间腺泡细胞在体内平衡和再生期间重新填充胰腺。

KRAS中的激活突变通常与人类PanIN相关，并且足以在小鼠中诱导PanIN的形成。在小鼠遗传学研究中，Kras通常在整个腺泡室或整个胰腺中被激活，导致在青霉素治疗后一周内，正常胰腺广泛转化为潘宁。为了以更接近人类的方式模拟KRAS的克隆激活，评估了在罕见的大腿间腺泡细胞中特异性激活KRAS的效果。为此将Tert CreER小鼠与条件Cre依赖性突变Kras G12D株杂交，产生TertCreERT2/+；KrasLSL-G12D/+；Rosa26LSLTOMATO/+（Tert CreER；Kras）小鼠。突变Kras在加速腺泡克隆形成方面的这些作用在用蓝耳素治疗的小鼠和未经治疗的小鼠中都可以看到。为了比较Kras与随机腺泡细胞在促进大腿间细胞转分化和转化方面的作用，评估了两个队列中导管化生和PanIN形成的频率。化塑性区域和PanIN区域在Tert CreER中均显著增加。值得注意的是，在Ptf1a CreER中使用高剂量他莫昔芬（5 mg）治疗；通过导管形态、突出的顶端粘蛋白、阿尔辛蓝和MUC5A染色，可以明显观察到PanINs。KRAS的突变激活导致下游信号通路的持续激活，包括MAPK和PI3K。与MAPK的参与一致，侵袭性PDAC和PanIN通常表达下游蛋白激酶MEK和ERK的活化磷酸化形式。在Kras驱动的胰腺癌小鼠模型中，MAPK信号对PanIN的形成非常重要。为了研究腺泡克隆到盘宁过程中的MAPK信号，使用抗磷酸化ERK1/2、导管标记物CK19和TOMATO的抗体对切片进行染色。pERK在每个克隆少于10个细胞的小腺泡克隆中无法检测到，而在从大腿间腺泡细胞衍生的较大腺泡克隆中很容易检测到。在PanIN病变中，pERK信号进一步升高，而TOMATO水平降低，这可能反映了导管状态下普遍存在的指导TOMATO表达的启动子下调。这些数据表明大腿间腺泡细胞中的突变Kras激活与损伤一起导致腺泡克隆扩张、进行性pERK上调和随后的PanIN损伤形成。图3|Kras激活和损伤后，大腿间腺泡细胞开始胰腺肿瘤形成。

为了研究腺泡细胞扩张是否是胰腺肿瘤发生的潜在早期步骤，检测了PDAC患者、慢性胰腺炎患者以及浆液性囊腺瘤（SCA）或黏液性囊状肿瘤（MCN）患者切除的胰腺标本中的pERK染色。病理学家对切除的人类PDAC样本进行评估，以确定含有PanINs和相邻腺泡组织的组织块。发现PanINs通常对pERK呈阳性，而大多数腺泡组织和胰岛为pERK−。在38名患者的染色切片中，在总共20名患者中确定了pERK+腺泡病变。来自无胰腺疾病个体的胰腺尸检样本显示没有pERK+腺泡病变。这些发现表明，在PDAC和其他肿瘤患者切除的胰腺标本中，常见pERK+腺泡病灶病程与慢性胰腺炎。腺泡细胞或导管细胞中的KRAS突变尚未被检测到，这使得人类中PanINs的起源尚不清楚。为了了解这些pERK+腺泡病变是否含有KRAS突变，进行了激光捕获显微切割（LCM），然后对KRAS基因的5′部分进行PCR扩增并进行下一代测序。从切除的病变胰腺中分离出的18个pERK+腺泡区中有5个检测到KRAS突变。所鉴定的突变仅为G12D，这是人类胰腺癌中最常见的KRAS突变。突变的等位基因频率在19.9%到73.1%之间。作为对照，随机抽取了pERK−胰腺腺泡细胞区和尸检病例。发现34个样本中有32个仅显示野生型KRAS序列，然而，在pERK中发现了两个突变KRAS序列样品。这些数据共同揭示了胰腺疾病患者样本中存在pERK+腺泡病变。此外，这些pERK+腺泡病灶因KRAS中存在激活突变而富集，表明pERK是腺泡细胞室中KRAS突变的潜在标记物。图4|鉴定含有KRAS突变的pERK+人腺泡细胞。

本文研究提供了支持一个统一的模型将胰腺外分泌的更新机制与胰腺癌的发生联系起来。在体内平衡过程中，罕见的大腿间腺泡细胞通过产生扩大的克隆来促进腺泡细胞的更新，但在化学损伤过程中，这一过程会加快，同时也会招募更多的腺泡细胞形成克隆。本文的数据表明，如果大腿间腺泡细胞在复制过程中持续发生Kras突变，这种突变反过来会带来选择性生长优势，产生最初保留腺泡形态的癌前细胞克隆。这些癌前腺泡细胞克隆的扩展将代表一个异常区域，作为一个蓄水池，用于积累转分化为PanIN命运所需的额外遗传和表观遗传变化，并最终产生完全转化的癌症。在人类PDAC样本中发现的含有KRAS突变的pERK+腺泡病变支持这种腺泡克隆扩张假说。腺泡病变中KRAS突变的鉴定与显示衰老组织中正常细胞中存在癌基因突变的新数据一致。慢性器官损伤（如胰腺炎）增加腺泡祖细胞的增殖和发生KRAS突变的可能性，同时进一步促进KRAS突变克隆的生长和PDAC发生的风险。PDAC发育过程中腺泡细胞扩张步骤的鉴定为早期阻断胰腺癌提供了方法。图5 |胰腺肿瘤形成途径上的早期事件。

教授介绍：

Steven Artandi

Steven Artandi博士是斯坦福癌症研究所的Laurie Kraus Lacob主任，也是斯坦福大学医学和生物化学的Jerome和Daisy Low Gilbert教授。他还担任斯坦福医学院癌症项目的首任高级副院长和斯坦福医疗保健的首席癌症官。他在普林斯顿大学获得学士学位，在哥伦比亚大学获得医学博士和博士学位。2000年加入斯坦福大学之前，他曾在麻省总医院接受内科培训，并在达纳法伯癌症研究所接受肿瘤学培训。

Artandi博士是一位肿瘤学家和癌症生物学家，他的研究工作集中于端粒酶在癌症、衰老和干细胞功能中的作用。他的工作对癌症的起源产生了新的见解，揭示了端粒酶如何赋予细胞不朽的生长特性，以及有志成为癌症的人如何绕过癌症发生过程中遇到的关键瓶颈。他曾获得多项奖项，包括美国国家癌症研究所颁发的杰出研究员奖，并且是美国科学进步协会、美国临床研究学会和美国医师协会的当选成员。他是《分子癌症研究与干细胞》杂志的编辑委员会成员。

参考文献：

Patrick Neuhöfer，Caitlin M. Roake，Steven E. Artandi et al.Acinar cell clonal expansion inpancreas homeostasis and carcinogenesis. [J] Nature.15 September 2021.