转录组定量工具-featureCounts安装及使用

        计算表达量可以用 StringTie、Htseq-count或featureCount ，第一次做转录组分析时，参照了一篇Cell的子刊文章的分析方法，里面使用的STAR+featureCount，就直接用了这个软件，也就没再使用别的，回头看第一次使用时，发现好多细节没有注意到，温故而知新。featureCount是subread软件包里的一个命令，所以安装subread即可。而subread又有命令行版和R版，有服务器，自然选择命令行版了。

featureCounts，有两个核心概念：

       Feature: 指的是基因组区间的最小单位，比如exon;

       Metafeature: 可以看做是许多的feature构成的区间，比如属于同一个gene的外显子的组合。

       在定量的时候，支持对单个feature 定量(对外显子定量), 也支持对meta-feature进行定量(对基因进行定量)。当reads比对到2个或者以上的features 时，默认情况下，featureCounts在统计时会忽略到这部分reads, 如果你想要统计上这部分reads,可以添加-O 参数，此时一条reads 比对到多个feature，每个feature 定量时，都会加1。对于meta-features来说，如果比对到多个features 属于同一个 meta-features(比如一条reads比对到了exon, 但这些exon属于同一个gene), 则对于这个gene 而言，只会计数1次。总之，不管对于feature 还是meta-feature,只有比对多个不同的区间时，才会分别计数。

一、软件下载及安装：

  首先是官方网站

        https://sourceforge.net/projects/subread/

        http://subread.sourceforge.net

二、参数说明：

-a 指定注释文件

-o 指定结果输出目录及文件名

-p 能用在paired-end的情况中，会统计fragment而不统计read

-t 指定feature的类型，默认是exon，当然gtf里面还有gene、CDS或者直接以feature命名的分类方式。

其它参数：

 -f参数  该参数设置后统计的是feature层面（默认是exon）的参数，如果不设置则是直接统计meta-feature参数（即一个gene中的多个exon）

这时按exon分类进行统计，但是由于没有设置-f，在同一个gene内的exon会被统计成一个meta-feature，但是每个exon仍然会被显示出来，遇到一个gene有多个exon的时候看着就很乱。

第二种：然后我加上-f，这样设置-t exon -f , 看一下结果：

        我现在还不确定-f参数及-t参数对后面差异表达会不会有影响，初步判断不会的，但我注意到，-t gene -f设置后，count计数基于gene 层面，就不会出现相同基因的不同外显子count值，也就是第一列不会出现重复，并且可以直接得到基因信息，避免了注释、删除重复这个过程，我们做转录组测序，不就是想看基因水平的变化吗，我觉得这是很好的一个参数设置，不知道为什么网上一堆的帖子都没有这样设置，官网上示例也只是-t exon。希望未来有人和我讨论一下这个问题。

最终：我基于自己的理解，加上-t gene -f参数了。

三、结果

1、运行过程情况：

        Successfully assignedalignments: 14212190 (32.7%), 说明只有32.7的paired reads 定量到了基因上，如果想知道那些没有分配上的reads是出于什么原因，则可看下图，输出中的summary文件。

     Unmapped: 没有比对上；     

     MultiMapping:多个序列比对在有限的序列区域上，即参考组上有多个匹配点； 

     NoFeatures: 其比对与任何基因都不重叠； 

     ambiguous: 其比对与多个基因重叠。

2. 合并不同样本的count文件：

        join count1.txt count2.txt > count_12.txt

        或者先提取出来每个样本的第一列和第七列信息，再通过join合并

        cut -f 1,7 count1.txt | grep -v ‘^#’ >count1_cut.txt

        这样就能得到所有的样本的Count矩阵了。

总结：使用这个工具时要根据不同的项目，不同的目的，参数也要进行适当的调整，尤其是模式生物和非模式生物研究时，一定要想想参数设置合适不合适，我不认为写好了一个流程，就可以用来做所有课题的转录组分析了。这也是自己会和交给公司来做最大的好处了，自己的课题，只有自己才能对数据结果负责。

附：

STAR有一个参数-quantMode，可以指定--quantMode GeneCounts输出STAR计算出的reads计数结果，如果是比对完之后未做转录本拼装，直接对已知基因（构建基因组索引时GTF中囊括的基因）进行定量时，完全不需要再次用featureCounts或HTSeq再计算reads count。以后试试。

参考：

https://www.jianshu.com/p/9cc4e8657d62

http://www.360doc.com/content/21/0714/12/76149697_986499746.shtml

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24227677/

http://subread.sourceforge.net/featureCounts.html

http://subread.sourceforge.net/RNAseqCaseStudy.html

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