尝试做细菌完成图的你是不是有很多疑问
这份避坑指南请收好!
小坑1、“1 +X Contig,0 Gap”代表什么?
答:“1 Contig,0 Gap”的承诺保证了组装的完整性。但细菌基因组也存在多条染色体的现象,染色体本身又分线性和环状两种情况,受限于细菌本身客观情况的需要具体调整。凌恩生物超过几百个完成图的项目经验,多种微生物包含多个环、多个质粒,我们承诺都可以完成。。。
小坑2、致病菌可以做细菌完成图吗?
答:需要提供菌的拉丁名给公司进行确认,传染性太高的菌可能无法承接。
小坑3、细菌完成图的分析需要多长时间?
答:五个工作日。
小坑4、细菌完成图的结构注释包括哪些?
答:基因预测(gene、CDS、tRNA、rRNA、23S rRNA 、16S rRNA、5S rRNA 、miscRNA、tmRNA);假基因预测;CRISPR 序列预测;基因岛预测;前噬菌体预测;重复序列预测;次级代谢基因簇预测。
小坑5、功能注释包括哪些数据库?
答:标准分析通用数据库(Nr、KEGG、GO、Swiss-Prot、COG、CARD、CAZy)及专有数据库(VFDB、PHI、Antismash、TCDB、ARDB、Pfam、CYP450)。
小坑6、做细菌完成图的DNA有什么要求?
答:DNA样品澄清透明,总量≥2 μg;
DNA纯度OD260/280在1.8-2.0之间;
DNA浓度≥10 ng/μL;
DNA完整无降解,无RNA、蛋白质等污染。
小坑7、需要提供什么样本?
答:提供单菌菌体样本。
菌体液体培养至对数期,OD600约0.6-0.8,收集菌体3-5ml,1.5ml离心管低温4度离心,弃上清,保留管底菌体。将离心管封口,立即液氮速冻,-80℃保存,干冰送至实验室。
1、不建议送平板和带液体培养基的,如有需求,请提前和实验室沟通。
2、一定是生长对数期的菌体;
3、细菌得率有高有低,细菌是经常提取不成功的一类物种,很大原因是菌体量过少。
大坑1、细菌基因组能保证完成图水平吗?
答:除以下情况之外,可以保证达到完成图水平,我们承诺100%项目获得完成图。
a. 基因组大小>7M;基因组大小不限,最大基因组完成图14mb链霉菌;
b. 样品不纯(包括但不限于其它物种序列污染);污染比例低于5%都可以承诺;
c. 染色体基因组个数+质粒个数>4;
d. 转座子或其它重复序列在基因组中的比例异常高(>10%);
e. 最长重复序列大于9K;
f. GC比例低于30%或高于70%。
以上情况特殊的项目,本公司项目经验丰富均可承接,并承诺组装做到最好。
大坑2、装出来的基因组的准确性怎么样?
答:由于HiFi数据兼具长读长和高质量的特性,在基因组组装中无需纠错,可实现基因组的快速组装,让基因组组装进入“高铁”时代。
大坑3、做完成图可以顺便做甲基化吗?
答:可以的,细菌完成图与细菌甲基化的实验流程是一致的,可以共用一份数据。要求数据量更高,推荐300x以上的覆盖度。
大坑4、是否能组装得到质粒?
答:可以的。我们承诺组装得到该菌株的全部质粒基因组。
天坑——如遇到菌株污染情况怎么办?
答:凌恩生物提供一代菌种鉴定服务,建议对待测样本先进行一代菌种鉴定,确认是单菌之后再进行后续实验及分析。如已进行了全部实验分析,发现有污染情况,可尝试通过加测数据量的方式使待测菌种达到目标深度,但依然建议在实验初期规避污染。
一般菌株污染情况包括种内污染和种间污染。首先,我们先搞清楚种内种间的概念。
种间:指不同物种种群之间的相互作用,属于不同物种;
种内:指同种生物个体之间的相互作用,属于相同物种。
如下图,沙门与大肠就属于种间关系,K-12和857C属于种内关系,其都属于大肠杆菌。
种内污染:相同物种、不同菌株混合在一起的样品,即下图中K-12与857C两个大肠菌株没有分离成功,而混合在一起抽提DNA,进行后续基因组组装的过程。
我们以三种常见的细菌作为测试对象:
李斯特菌:Listeria monocytogenes
沙门氏菌:Salmonella Heidelberg
大肠杆菌:Escherichia coli
(1)当单菌没有污染时,即不存在种内污染时,contigs数量最少,N50最长;
(2)当存在种内污染时,基因组总长度会变大,contigs数量明显增加,N50明显降低;
(3)质量的下降与污染比例呈现正相关,污染比例越高,质量越差。
种间污染:放入种间物种进行多角度分析,通常是两种情况,即基因组大小异常和单倍型丢失率。
(1)从基因组大小来看,种间还是影响更大(非常容易理解,污染了其他物种基因组,组装结果中拥有污染物种序列,明显会增大);
(2)从单倍型丢失角度来看,种内物种的影响明显大于种间,尤其是污染超过20%以后,对于组装质量的破坏极其严重。
总结:种间污染不可怕,除了组装大小偏大,其他影响较小,而且可以通过生物信息方法排除污染,改善组装质量;但是种内污染比较麻烦,不容易排除污染,会让人束手无策,无法改善结果。
特别提示:
为确保实验的顺利,建议样品备份1-2份,以防备部分样品降解重新取材、制备或送样,耽误时间。
公司完成图
(部分文章列表)
1. A novel ATP dependent dimethylsulfoniopropionate lyase in bacteria that releases dimethyl sulfide and acryloyl-CoA.Elife,2021.(IF=8.146)
2. The Second Chromosome Promotes the Adaptation of the Genus Flammeovirga to Complex Environments.Microbiol Spectr,2021.(IF=7.171)
3. Increasing prevalence of hypervirulent ST5 methicillin susceptible Staphylococcus aureus subtype poses a serious clinical threat .(IF=7.163),2021.Emerging Microbes & Infections
4. Genomic Investigation of Proteus mirabilis Isolates Recovered From Pig Farms in Zhejiang Province, China.Frontiers in Microbiology,2022. (IF=6.064)
5. Characterization of metabolite, genome and volatile organic compound changes provides insights into the spoilage and cold adaptive markers of Acinetobacter johnsonii XY27.LWT,2022. (IF=6.056)
6. Regulation of bla system in ST59-related oxacillin-susceptible mecA-positive Staphylococcus aureus.J Antimicrob Chemother,2021.(IF=5.79)
7. Tetracycline degradation by Klebsiella sp. strain TR5: Proposed degradation pathway and possible genes involved.Chemosphere,2020.(IF=5.778)
8. Complete genome sequence of the deep South ChinaSea-derived Streptomyces niveus SCSIO 3406, the producer of cytotoxicand antibacterial marfuraquinocins. Plos One, 2021. (IF=2.740)
9. Comparative genomic analysis of iprodione-degradingPaenarthrobacter strains reveals the iprodione catabolic molecular mechanism inPaenarthrobacter sp. strain YJN-5. Environmental Microbiology, 2020.(IF=4.933)
10. A novel strain of acetic acid bacteria Gluconobacteroxydans FBFS97 involved in ribofavin production. Scientific Reports, 2020.(IF=3.998)
11. An angular dioxygenase gene cluster responsible forthe initial phenazine-1-carboxylic acid degradation step in Rhodococcus sp.WH99 can protect sensitive organisms from toxicity. Science of the TotalEnvironment, 2020. (IF=5.589)
12. Novel Black Yeast-like Species in Chaetothyrialeswith Ant-associated Life Styles. Fungal Biology, 2020. (IF=2.789)
13. Assembly and analysis of the whole genome ofArthroderma uncinatum strain T10, compared with Microsporum canis and Trichophytonrubrum. Mycoses, 2020. (IF=3.065)
14.. Characterization of a Linezolid- andVancomycin-Resistant Streptococcus suis Isolate That Harbors optrA and vanGOperons. Frontier in Microbiology, 2019. (IF=4.259)
15. Population Structure and Antimicrobial ResistanceTraits of Avian-origin mcr-1-positive Escherichia coli in Eastern China, 2015to 2017. Transboundary and Emerging Diseases, 2019. (IF=3.554)
16. Emergence of plasmid-mediated oxazolidinoneresistance gene poxtA from CC17 Enterococcus faecium of pig origin. Journal ofAntimicrobial Chemotherapy, 2019. (IF=5.113)
17. Genome mining and metabolic profiling illuminate thechemistry driving diverse biological activities of Bacillus siamensis SCSIO05746. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019. (IF=3.670)
18. Circulation and Genetic Diversity of FelineCoronavirus Type I and II From Clinically Healthy and FIP-Suspected Cats inChina. Transboundary and Emerging Diseases, 2019. (IF=3.554)
19. Comparative genome analysis reveals the evolutionof chloroacetanilide herbicide mineralization in Sphingomonas wittichii DC‑6.Archives of Microbiology, 2019. (IF=1.642)
20. Relationship between tetracycline antibiotic susceptibility and genotype in oralcavity Lac clinical isolates. Antimicrobial resistance and infection control,2019. (IF=3.568)
21. Complete Genome Sequence of Cd(II)-ResistantArthrobacter sp. PGP41, a Plant Growth-Promoting Bacteriumwith Potential in Microbe-Assisted Phytoremediation. Current Microbiology, 2018.(IF=1.373)
22. Characterization and heterologous expressionof the neoabyssomicin/abyssomicin biosynthetic gene cluster from Streptomyces koyangensisSCSIO 5802. Microbial Cell Factories, 2018. (IF=3.831)
23 Phylogeny of dermatophytes with genomic characterevaluation of clinically distinct Trichophyton rubrum and T.violaceum. Studies in mycology, 2018. (IF=11.663)
24. Genome Sequencing of Streptomyces atratus SCSIOZH16and Activation Production of Nocardamine via Metabolic Engineering. Frontier inMicrobiology, 2018. (IF=4.076)
25. Biodegradation of di-n-butyl phthalate (DBP) by anovel endophytic Bacillus megaterium strain YJB3. Science of the TotalEnvironment , 2017. (IF=4.610)
26. Deciphering the sugar biosynthetic pathway andtailoring steps of nucleoside antibiotic A201A unveils a GDP-L-galactose mutase.PNAS, 2017. (IF=9.423)
27. Biosynthesis of ilamycins featuring unusualbuilding blocks and engineered production of enhanced anti-tuberculosis agents.Nature Communications, 2017. (IF=12.353)
28. The complete genome sequence of Bacillus velezensis9912D reveals its biocontrol mechanism as a novel commercial biologicalfungicide agent. Journal of Biotechnology, 2017. (IF=2.533)
29. Comparative genomic analysis of isoproturon-mineralizing sphingomonads reveals the isoproturon catabolic mechanism.Environmental microbiology, 2016. (IF=4.974)