凌恩客户文章|宏基因组揭示大蒜素对抗生素抗性基因的影响

凌恩生物客户最新合作文章“Metagenomic approach reveals the fates and mechanisms of antibiotic resistance genes exposed to allicins during waste activated sludge fermentation: Insight of the microbial community, cellular status and gene regulation”发表在工程技术1区期刊Bioresour Technol（IF=9.64）。

背  景

在过去几十年里，抗生素的过度使用导致大量抗生素释放到环境中，诱导抗生素耐药基因(ARGs)在微生物之间的潜在传播，污水处理厂接收的工业和城市废水中含有大量抗生素和ARG，最终在活性污泥(WAS)中积累，造成了巨大的生态风险。大蒜素是WAS中的一种新出现的污染物，有研究表明大蒜素通过干扰细胞膜的稳定性进而影响细菌状态和代谢活动。微生物作为ARG的宿主，其群落结构、代谢活性的变与ARG的繁殖和转移密切相关。然而，WAS中大蒜素是否会影响WAS发酵过程中ARGs的分布，其作用机制尚不清楚。本研究旨在揭示大蒜素对WAS发酵过程中ARGs的影响。

研究材料

污水处理厂收集WAS，在4℃下浓缩24h，过滤去除颗粒无机物，浓缩WAS的参数：总悬浮物(TSS) 20120mg/L，挥发性悬浮物(VSS)8910mg/L，可溶性化学需氧量395mg/L，可溶性蛋白25.4 mg/L；可溶性碳水化合物9.5 0.8 mg/L；大蒜素纯度:95%。

实验方法

在600mL锥形瓶+300 mL浓缩WAS	+ 0（对照组）	密闭保持厌氧条件，35℃、180 rpm的摇床
	+ 0.01g/g TSS 大蒜素（低剂量组）
	+ 0.05g/g TSS 大蒜素（高剂量组）

对可溶性微生物产物和胞外聚合物(EPS)进行分析，同时测定了乳酸脱氢酶(LDH)的释放量和三磷酸腺苷(ATP)的浓度，以此来指示细胞膜的裂解和细胞的活性。在发酵试验结束时，通过宏基因组分析不同发酵反应器中ARGs和微生物种群的情况。

实验结论

1. 大蒜素影响WAS发酵过程中ARGs的分布

大蒜素的存在对WAS发酵过程中ARG有明显影响。在大蒜素低剂量下，约有15种ARGs类型下调，总ARGs丰度分别降低了4.84%；在大蒜素高剂量下，共有315个ARGs特异表达，204个ARGs下调，总ARGs丰度分别降低了9.42%；WAS中主要的ARGs类型为：multidrug -、macrolide-、万古霉素-和四环素类，它们在不同分组中的差异很大。

 图 ARGs在不同WAS发酵系统中的分布规律

2. 大蒜素诱导WAS发酵过程中胞外聚合物的裂解

胞外多糖（EPS）是ARGs-宿主的保护屏障，因此EPS的裂解有助于ARGs的去除，在WAS发酵过程中，通过检测EPS的主要成分蛋白质和碳水化合物的浓度来反映EPS的破坏率。当锥形瓶中含有大蒜素时，蛋白质和碳水化合物等的含量均有提高，表明大蒜素调控提高了WAS的溶解作用。

图 大蒜素对可溶性基质的影响及EPS浓度

3. 大蒜素改变微生物细胞状态

ARG的存在依赖细菌细胞的完整性，在大蒜素浓度为0.01和0.05 g /g TSS的条件下，LDH（细胞膜损伤的直接指标）的释放量是对照组的1.56和12.63倍。此外，在大蒜素的存在下，膜运输、复制和修复的基因丰度高表达，这是对细胞膜破坏的刺激和反应。ATP是微生物代谢系统的直接功能物质，添加0.01和0.05 g大蒜素/g TSS后，ATP水平从对照的2.67 μM/L下降到1.85和1.29 μM/L。大蒜素的存在导致了细胞损伤的加重和细胞膜通透性的增加，这将有助于细菌宿主在WAS发酵过程中释放ARGs并降低其含量。

 图 LDH释放，ATP浓度

4. 大蒜素影响菌群的变化及其与ARG的共生关系

大蒜素的存在使绿弯菌属(Chloroflexi)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)的相对丰度呈下降趋势。通过共现网络分析揭示ARGs与微生物之间潜在的共生关系，不同的ARG与不同的菌密切相关，大蒜素可以通过改变微生物种群来降低ARGs。

 图 大蒜素对WAS发酵反应器细菌群落相对丰度的影响及共现网络分析

5. 大蒜素诱导ARGs传播的代谢途径和基因表达调控

本研究中ARGs抗性机制主要为抗生素靶点改变和抗生素外排泵，且在大蒜素胁迫的反应器中呈下降趋势。对靶点改变起作用的ARGs由对照的38.59%下降至38.21和37.64%；随着大蒜素浓度的增加，附属于外排泵的ARGs的丰度降低。因此，大蒜素通过影响WAS发酵系统中ARGs的抗性机制(即靶点改变改变和外排泵)来降低ARGs的丰度。另一方面，在大蒜素胁迫下，能量代谢、信号转导、辅助因子和维生素的代谢通路下调，进而阻碍了ARG的传播和转移。大蒜素的存在显著降低了双组分体系（最常见的信号转导机制）的表达水平，双组分系统的关键基因(cusS、narX、uhpB、degS、rstB和rcsC)均显著下调。此外，大蒜素胁迫下反应器中群体感应和SOS反应的下调也是ARGs降低的原因。

图 双组分系统关键基因、群体感应、SOS响应

总之，活性淤泥发酵过程中大蒜素的存在可以降低ARGs的丰度。大蒜素通过调节细胞状态、群落结构以及遗传调控来降低ARGs的丰度。一方面，大蒜素破坏EPS结构，增加膜的通透性，导致ARGs的释放，进而很容易被清除；另一方面，大蒜素通过降低细胞能量水平、宿主的丰度以及参与ARGs传播的关键通路和基因的表达来抑制ARGs的传播。

参考文献：Metagenomic approach reveals the fates and mechanisms of antibiotic resistance genes exposed to allicins during waste activated sludge fermentation: Insight of the microbial community, cellular status and gene regulation