发酵中药概述
作者 山东巴德生物科技有限公司 郑 全博士
中药发酵目录●
一 发酵的概念及历史
● 二 中药生物转化的反应类型
● 三 发酵工程的内容及发酵方式分类
● 四 根据发酵的目的把微生物发酵进行分类
● 五 发酵工程中常用的微生物
● 六 发酵培养基的组成
● 七 影响发酵的主要因素
● 八 中药发酵的目的
● 九 发酵技术与中药炮制
● 十 中药的生物转化的主要类型
● 十一 发酵技术在中药生产中的应用
● 十二 中药的生物转化案例
发酵的概念及历史
● 发酵概念-人们将利用微生物的生命活动，以获得微生物菌体或其代谢，转化的产物的过程，叫发酵。
● 发酵的历史
● 1 酿酒是最早的历史。
● 2 19世纪到20世纪30年代，发酵产品如：乳酸，乙醇，丙酮，丁醇，淀粉酶，蛋白酶等。
● 3 1929年弗莱明发现了青霉素以来，抗生素的发酵生产为现代微生物发酵工程积累了丰富的经验。
● 4 现代发酵工程生产了：干扰素，白细胞介素，多种细胞生长因子，氨基酸，有机酸，维生素，酶制剂，基因工程药物，微生物转化发酵产品及其他生物活性物质。
● 据有关资料统计，通过发酵生产的抗生素品种多达200多个，某些发达国家，发酵工业占国民生产总值的5%。
生物转化的反应类型● 生物转化的实质是酶促反应，常用的反应类型如下：
● 1 氧化反应 单加氧 羟基化 环氧化 氨杂基团氧化 β-氧化 脱氢
● 2 还原反应 羰基还原 杂氮基团还原
● 3 水解反应 酯和内酯的水解 醚的水解和开裂 苷的水解 酰胺和内酰胺的水解 环氧水解 水解脱胺 水解胺烷基中烷基
● 4 缩合反应
● 5 胺化反应
● 6 酰基化反应
● 7 降解反应
● 8 脱水反应
● 9糖基化反应
发酵工程的内容及发酵方式分类
● 1 生产菌的选育。
● 2 发酵条件的优化与控制，生物反应器的设计。
● 3 发酵产物的分离，提取与精制过程。
● 根据发酵方式分为厌气发酵和通气发酵二大类。
● 厌气发酵:乙醇发酵，酒类发酵，丙酮丁醇发酵，乳酸发酵和甲烷发酵等。
● 通气发酵包括:酵母培养，有机酸发酵，抗生素发酵，氨基酸发酵，酶制剂的生产和多糖发酵等。
根据发酵的目的把微生物发酵进行分类● 一 以获得微生物菌为目的的发酵
● 发酵产生茯苓，香菇，冬虫夏草，灵芝等药用真菌；发酵产生白僵菌，绿僵菌，苏云金芽孢杆菌等菌体，用以制备生物杀虫剂；以及传统的发酵生产单细胞蛋白，酵母菌等。
● 二 以获得酶制剂为目的的发酵
● 用于食品工业的淀粉酶，糖化酶，用于临床检测的胆固醇氧化酶，葡萄糖氧化酶。
● 三 以获得微生物的初级或次级代谢产物为目的的发酵
● 初级代谢产物：氨基酸，蛋白质，核酸，核苷酸，多糖。次级代谢产物：抗生素，生物碱，细菌毒素，植物生长因子。
● 四 以获得低毒，高效的新物质为目的发酵
● 利用微生物的氧化，还原，脱水，脱羧，异构化等。比如把L-山梨醇转化为L-山梨糖，葡萄糖转化为葡萄糖酸。
发酵工程中常用的微生物● 一 细菌-单细胞原核生物
● 大肠杆菌，醋酸杆菌，乳酸杆菌，丙酮丁醇梭菌，肠膜状明串珠菌，双歧杆菌，丁酸梭菌等。
● 二 放线菌
● 放线菌最大的经济价值是能产生多种抗生素，如链霉素，土霉素，金霉素，红霉素，氯霉素，争光霉素，卡那霉素等。从自然界分离了5000多种抗生素，其中4000多种来自于防线菌。
● 1 链霉菌属 多种链霉菌能产生抗生素，如灰色链霉菌产生的杀稻菌素S可用于稻瘟病的防治。
● 2 小单孢菌属 如绛红小单孢菌和棘孢小单孢菌都能产生庆大霉素。
● 3 若卡菌属 如利福霉素，蚁霉素等。
● 4 游动放线菌属。
发酵工程中常用的微生物● 三 霉菌
● 霉菌是指在营养基上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌，亦称为丝状真菌。大多为好氧微生物。生产乙醇，枸橼酸，青霉素，淀粉酶，果胶酶，纤维素酶，蛋白酶，多糖和甾体激素等。
● 1 青霉属
● A 产黄青霉 产生多种酶和有机酸。产生青霉素，葡萄糖氧化酶或葡萄糖酸，枸橼酸和抗坏血酸。
● B 桔青霉 桔青霉可以生产桔霉素，也可以产生脂肪酶，葡萄糖氧化酶和凝乳酶。
● 2 根霉属
● 其淀粉酶的活性很高，可用作酿酒工业上的淀粉原质的糖化菌，在根霉中还含有酒化酶。根霉能产生有机酸：反二烯丁酸，乳酸，琥珀酸和芳香的酯类物质。
● A黑根霉 产生反丁烯二酸和果胶酶。
● B米根霉 酒药和酒曲中常见到。该菌有淀粉糖化，蔗糖转化等性能。能产生乳酸，反丁烯二酸。
● C 华根霉 产生乙醇，芳香酯类等。它是酿酒所必需的主要霉菌，也是酸性蛋白酶和腐乳生产中的主要菌种。
发酵工程中常用的微生物● 3 曲霉属
● A 黑曲霉 具有多种活性强大的酶系，可以生产酸性蛋白酶，淀粉酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，还能产生多种有机酸，如抗坏血酸，枸橼酸葡萄糖酸和没食子酸。
● B 米曲霉 含有多种酶类，具有较强的蛋白分解能力，又有糖化能力，很早用于酱油和酱类生产。是蛋白酶和淀粉酶的生产菌。
● 4 红曲属 红曲能产生淀粉酶，蛋白酶，枸橼酸，琥珀酸，乙醇，麦角甾醇，该菌株可以生产红曲红素和红曲黄素，最适PH3.5-5.0。用紫红曲霉支撑的中药红曲，具有消食活血，健脾胃的功效。
发酵工程中常用的微生物● 酵母是单细胞真核微生物，主要分布于含糖质较多的偏酸性环境中。酵母菌落多呈乳白色，常用
有酵母属和假丝酵母属。
● 1酵母属 常用的是啤酒酵母。其菌体的维生素，蛋白质含量高。也可以用来提取核酸，麦固醇，谷胱甘肽，细胞色素C，凝血素，辅酶A和ATP。
● 2 假丝酵母属 常见的有产朊假丝酵母，解脂假丝酵母，热带假丝酵母等。
● 产朊假丝酵母其蛋白质和维生素的含量比啤酒酵母高。
● 解脂假丝酵母，不发酵任何糖，能分解脂肪。
● 热带假丝酵母，氧化烃类的能力很强，以石油为原料生产单细胞蛋白的重要菌种。
● 3 红酵母属
● 有较好的产生脂肪的能力，有的中具有对烃类的弱氧化作用，并能合成β-胡萝卜素。
发酵培养基的组成
● 1 碳源 氮源
● 2 无机盐和微量元素
● 3 生长因子 水
● 4 代谢产物的前体，诱导物和促进剂。
● 营养成分的适当配比，PH值的调控（缓冲剂和不溶性的碳酸盐），渗透压和培养基的氧化还原电位。
影响发酵的主要因素
●1 温度 PH 溶氧 泡沫
中药发酵的目的● 一 充分释放中药的有效成分
● 1 植物细胞壁由纤维素，半纤维素，果胶质，木质素等构成致密结构。用纤维素酶和果胶酶，可以破坏细胞壁的致密结构，释放有效成分。
● 二 为天然药物的生产提供了新的有效途径--结构修饰与定向合成
● 1 把生源关系相近或结构类似的化合物转化为特定的天然化合物；把资源丰富，活性较低的次生代谢生物转化为人类需要的稀有，昂贵的天然药物。如朱大元，余佰阳等发现多种微生物能定向地把喜树碱转化成10-羟基喜树碱。大连轻工学院的金教授利用糖苷水解酶，将人参皂苷Rb1等转化成含量只有十万分之几的人参皂苷Rh2和Rg3。
● 2 为天然药物结构修饰与设计提供了新的工具-获得新的高活性物质
● 利用化学法进行结构修饰获得高活性新化合物，费时，费力，且存在得率低，反应转一性差，副产物多等缺点。生物转化就没有上诉缺点。
中药发酵的目的● 三 结合药物筛选，为新药开发提供了研究手段
● 把中药的生物转化与高效快速药物筛选手段结合，寻找到新的高活性或低毒性的天然活性先导化合物。
● 四 提高天然活性成分的生物利用度。
● 较高纯度的天然活性成分往往溶解度差或体内吸收不好，造成天然活性成分常常在体内外药效学活性差异较大，而生物转化可以在解决此类问题的过程中发挥更大作用。
● 比如余佰阳利用微生物转化手段在青蒿素及其衍生物蒿甲醚，双轻青蒿素结构中引入羟基，增加了水溶性，而其抗疟作用活性中心过氧桥没有发生任何改变。
● 5 生物转化是除去复方中药制剂中大分子杂质的有效方法。比如利用水解蛋白酶去除蛋白质杂质，使出糖得出率大大提高，反之可以利用合适的酶去除糖类杂质。
发酵技术与中药炮制● 中药常用的发酵方式有二种:
● 1 直接用药材进行发酵：淡豆豉 百药煎 豆黄等。
● 2 用药材和面粉混合发酵：六神曲 建神曲 半夏曲 沉香曲等。
● 目的：增效，减毒，产生新的活性成分。
● 中药发酵研究中的难点与关键问题
● 1 中药自身体系的模糊性及中药成分的复杂性。
● 2 发酵理论的发展与完善 .
● 3 中药发酵机制的不明确性：中药化学成分复杂，作用机制不明确，中药的有效成分，一些非有效成分及特殊基质环境与微生物的相互作用尚待研究。
● 4 微生物生长特性的多样性。
中药的生物转化的主要类型
●一 生物碱的微生物转化 喜树碱变成10-羟基喜树碱。
●二 萜类化合物的微生物转化
●三 甾体化合物的微生物转化
●四 黄酮类化化合物的微生物转化
发酵技术在中药生产中的应用● 中药的液体深层发酵
● 一 虫草菌丝体的液体深层发酵生产
● 二 灵芝菌丝体的液体深层发酵生产
● 三 中药红曲的液体深层发酵生山
● 中药的固体发酵生产
● 槐栓菌的固体发酵生产
● 红曲的固体发酵生产
● 中药的有效成分发酵
● 1993年，美国人从红豆杉的树皮中分离到一种真菌，能直接生产紫杉醇。
● 曾金凤等分离获得了能够产生人参皂苷的一个青霉菌株，并以发酵的方式获得了人参皂苷。
微生物发酵炮制何首乌● 何首乌抗衰老，调节机体免疫力，降血脂，抗动脉粥样硬化，促进肾上腺皮质功能，其
主要成分为二苯乙烯苷类和蒽醌类化合物，后者被认为是何首乌致泻和肝毒性的主要成分。
● 杜晨辉等用米根霉发酵何首乌，把大黄素转化为大黄素-6-0-β-D-吡喃葡萄糖苷，从而降低了何首乌的泻下作用。在发酵过程中，将蒽醌类成分降解或生产毒性较低的化合物，符合：增效减毒的中药炮制目的。
中药刺五加的发酵炮制● 刺五加，扶正固本，补肾健脾，益智安神。
● 陈丽艳等用猴头菇炮制刺五加，实现了苷类成分的体外转化，有利于人体吸收；发酵后多糖含量大幅提高，增加了药效；同等剂量下，发酵物多糖的抗疲劳指标显著增强。
● 白玉海等用侧耳菌发酵刺五加，其发酵后的提取液能提高小鼠耐缺氧，抗疲劳，抗高温和抗低温的能力；同等剂量发酵后的刺五加提取液其抗应激作用增强。因此经侧耳菌发酵后可使有效成分生物利用度提高，药效增强。
微生物发酵炮制红花
● 红花作为一味活血通络，祛瘀止痛之良药，具有降血脂和抗血栓等作用，且具有较强的抗氧化作用。红花中抗氧化的有效成分是具有酚羟基的黄酮类化合物，如红花黄色素，红花素和槲皮素等。
● 冯志华等研究地衣芽孢杆菌C2-13发酵炮制对红花抗氧化活性的影响。发现红花经C2-13发酵炮制其抗氧化功能显著提高。HPLC分析还观察到红花中一些成分发生了改变。
五倍子的发酵炮制
● 五倍子含有鞣质，没食子酸等，有收敛止泻，止血的作用。收敛止泻作用主要是它含的鞣酸与细胞中的蛋白质结合成不溶于水的的沉淀物，从而抑制了细胞分泌，促进水液的再吸收而发挥收敛作用。但鞣酸在肠道内会遇到食物中的蛋白，并与之结合，因而降低了它的作用。
● 王和英根据酶学的有关理论，用根霉菌发酵五倍子，增强了五倍子的收敛作用。
黄芩的生物炮制
● 陈丽艳等研究发现，黄芩经黑曲霉发酵后，黄酮类成分发生变化，其黄芩苷的含量减少，而黄芩素和汉黄芩的含量分别是黄芩材料的2.73,5.77倍，提高了生物利用度和药理活性。
雷公藤甲素的生物转化● 雷公藤应用于治疗类风湿关节炎，肾小球肾炎，红斑狼疮等，但雷公藤因为肾毒性大，
应用受到限制。因此，生物转化，以期得到高效低毒的衍生产物。
● 1 用短刺小克银汉霉对雷公藤甲素（1-6）进行生物转化，得到7个产物，5-羟基雷公藤甲素（1-8），16-羟基雷公藤甲素（1-12）等。
● 2 雷公藤内酯酮的生物转化
● NING等利用黑曲霉对雷公藤内酯酮进行了转化，获得了四个产物：17-羟基雷公藤内酯酮（1-15），16-羟基雷公藤内酯（1-16）等。
蟾毒配基类● 蟾酥主要成分为蟾毒精（1-23），蟾毒灵(1-24)及脂蟾毒配基含量最高。主要作用:抗休
克，抗病毒，抗肿瘤活性。
● 1 果德安教授对蟾酥的3种成分进行了微生物转化，得到了进40个转化产物，其中23个为新化合物。
● 筛选了20余株真菌及细菌对华蟾毒精进行了转化，最后发现选择链格孢对蟾毒精进行转化，底物转化效率高，产物也较多。
● 2 应用细胞毛霉对脂蟾毒配基进行生物转化，获得了7个转化产物，11β-羟基-脂蟾毒配基（1-44)等。
大黄蒽醌类的生物转化
● 大黄富含大黄素，大黄酸，大黄酚，大黄甲醚，芦荟大黄素等蒽醌类化合物，是重要的致泻和抗菌活性成分。
● 1 张薇等利用微生物转化对大黄中的游离蒽醌类化合物进行结构修饰。筛选了21种微生物对大黄酚（1-54），大黄素甲醚（1-55),大黄素（1-56）进行了转化研究，最后确认：刺囊毛霉对大黄酚，大黄素甲醚，大黄素具有转化作用。
● 刺囊毛霉使大黄酚，大黄素甲醚糖苷化，对大黄素的转化是形成甲羟基转化物，β-羟基大黄素。
麻黄碱的生物转化● 麻黄碱又叫麻黄素，其差向异构体L-麻黄碱和d-伪麻黄碱是著名中药麻黄的主要活性成分。麻黄
碱属拟肾上腺激动药物，用于支气管哮喘，咳嗽，过敏，低血压等，还具有松弛平滑肌，收缩血管，加速心率，升高血压及中枢神经兴奋作用。伪麻黄碱为拟交感神经药，对收缩上呼吸道粘膜血管作用与麻黄碱相当，升压作用只有L-麻黄碱一半，对心血管和中枢神经系统兴奋作用明显弱于麻黄碱，但其加快心率，升高血压，中枢兴奋等不良反应较轻，且具有显著的利尿作用。临床上含麻黄碱与伪麻黄碱治疗感冒的复方中药很多：白加黑，新康泰克，银德菲，诺泰感冒片，治疗咳嗽的中成药喘宁胶囊，小儿止咳糖浆。
● 二 常规生产方式：
● 1 植物提取法。2 直接化学合成法，成本较高。印度，美国，澳大利亚，捷克等国家生产的麻黄碱大都是利用化学方法合成的。3 半生物合成法 :采用酵母细胞生物催化法将丙酮酸与苯甲醛缩合形成L-苯基乙酰甲醇，然后再经甲胺还原胺化即得L-麻黄碱。4 微生物直接转化法：董世建等筛选得到可专一性转化前体物质1-苯基-2-甲氨基丙酮生成d-伪麻黄碱的菌株。
延胡索素的生化转化
● 延胡索素为罂粟科植物延胡索块茎的化学成分,含有20多种生物碱，主要有延胡索甲素，延胡索乙素，延胡索丙素等，总称延胡索素。能和血散瘀，行气止痛，具有镇痛，镇静，安定及催眠作用。
● 其中延胡索乙素有优良的镇痛，镇静，催眠药物，低毒，安全，不成瘾。
● 中国药科大学余佰阳用链霉菌等10株菌进行筛选，发现灰色链霉菌可以转化延胡索总碱，将延胡乙素（L-THP)转化为左旋紫堇达明（L-CDL),后者的药理作用明显强于前者。
紫杉醇的微生物及酶法合成
● 紫杉醇的生物合成途径目前已经基本明了，其生物合成途径中多种酶的基因已经成功克隆，因此随着生物技术的不断发展，通过微生物及酶法实现大规模生产紫杉醇及其类似物终将实现。
紫衫醇是昂贵的抗癌中药，多烯紫杉醇抗癌活性稍高于紫衫醇，并较易溶于水。
紫杉醇的来源：1从红豆杉植物中提取是目前世界上生产紫杉醇的主要手段。2 化学合成。3 半合成:从植物中提取本身没有活性的紫衫烷二萜类成分，并以之作为前体半合成紫杉醇。4离体培养法。5 生物合成。1993年，有人从紫杉树上分离出来的内生植物真菌，能够产生紫杉醇，美国公司致力于开发用真菌生产紫杉醇的技术。
青蒿素的生物转化● 1青蒿素的来源：
● 1 从青蒿中提取 2 青蒿的化学全合成，产率0.25%。3 青蒿的半合成 把青蒿酸通过八步化学反应，合成青蒿素。
● 4 青蒿的生物合成
● A 通过添加生物合成的前提来增加青蒿的产量。
● B通过对控制青蒿素合成的关键酶进行调控，或者加入某些酶的激活剂来提高酶的效率。
● C 利用分子生物学的手段将酶的基因克隆出来，在转移到微生物中进行表达，达到通过基因工程菌发酵产生青蒿素。5 通过植物组织培养方法生产青蒿素。
● 青蒿素及其衍生物的生物转化
● LEE等利用珊瑚色诺卡菌和产黄青霉菌转化青蒿素，前者获得去氧青蒿素，后者得到去氧青蒿素和3α-羟去氧青蒿素。
● 陈有根等利用微生物灰色链霉菌转化青蒿素得到一个新化合物9α-羟基青蒿素，该产品具有抗恶性疟原虫活性。
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皂苷类的生物转化● 人参皂苷是人参的主要成分，人参皂苷均属于三萜皂苷，可分为三类 :二醇型，三醇型，齐墩果酸
型。人们把含量好的皂苷成分转化成稀有皂苷，人参稀有皂苷包括Rh2,Rh1,Rh3,Rg1,Rg3,Rg5，只存在于红参和野山参中。其中Rh2,Rh1,Rh3具有高抗癌作用，Rg3具有软化血管和抗癌的作用。稀有人参皂苷在红参及野山参中的含量只有十万分之几。
● 1 金教授发现人参皂苷糖苷酶只有在恶劣条件下才才产生，于是用人参皂苷糖苷酶，把栽培参中含量较高的Rb,Re,Rd,Rg1等生产Rh2等人参稀有皂苷。现在大连生生绿谷工程公司投产。
● 2 人参皂苷Rg1 是人参的益智的主要成分，预防老年痴呆；强化心肌细胞保护和心脏功能；抗疲劳作用；对皮肤衰老也有一定作用。但人参皂苷Rg1在人参中含量大约只有0.2%，而人参皂苷Re在人参中含量很高，且和人参皂苷Rg1的皂苷元相同，金教授利用微生物产生的皂苷-ɑ-属李糖苷酶，去掉了人参皂苷Re的C6位末端的一个α-鼠李糖苷酶，大量制备人参皂苷Rg1.
甘草皂苷的生物转化
● 甘草皂苷是甘草中主要的生理活性成分，甘草皂苷失去2分子糖基得到甘草皂苷元，某些生理活性要强于甘草皂苷。
● 吴少杰等用生物转化的方法，分别利用菌种为米曲霉39和黑曲霉UV-48酶水解法及液体发酵转化法进行转化，将甘草皂苷转化为甘草皂苷元。
黄酮类的生物转化
● 1 大豆异黄酮是大豆中含有的活性较高的生理活性物质。
● 大豆异黄酮共有12种异构体，分为游离型的苷元和结合型的糖二类。天然苷类的分子结构并不是活性最佳的状态，糖苷需要在大豆异黄酮糖苷水解酶的作用下转化，才能被吸收。因此大豆异黄酮糖苷水解酶对开发富含大豆异黄酮苷元的保健食品意义重大。
● 谢明杰从酒曲中分离出一株产大豆异黄酮糖苷水解酶活性较高的菌株。
黄酮类的生物转化
● 2 异槲皮苷是植物界分布较广的黄酮类物质，是芦丁的衍生物，结构上只比芦丁少一个鼠李糖。异槲皮苷由于具有抗氧化作用，其药理活性比芦丁还要高。
● 芦丁在自然界含量丰富，而异槲皮苷在自然界含量极低，只有万分之一或十几万之一。
● 王侃等在自然界中筛选出一种微生物菌株，该菌能生产水解芦丁上鼠李糖苷健的酶。
红景天苷的生物转化
● 红景天不但有抗缺氧，抗寒冷，抗疲劳，抗微波辐射等明显功能，还具备增强注意力，提高工作效率，延缓机体衰老，防治老年疾病等功效。
● 金教授，以酪醇和葡萄糖为底物，采用分离的菌株发酵获得的粗酶液为转化酶，最终合成红景天苷。
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