鬼笔环肽-iFluor 594偶联物的功能和应用

这种红色荧光鬼笔环肽偶联物（相当于 Alexa Fluor® 594 标记的鬼笔环肽）选择性地结合 F-肌动蛋白。以纳摩尔浓度使用，鬼笔环肽衍生物是用于标记、鉴定和定量甲醛固定和透化组织切片、细胞培养或无细胞实验中的 F-肌动蛋白的便捷探针。鬼笔环肽与肌动蛋白丝的结合比与肌动蛋白单体更紧密地结合，导致肌动蛋白亚基从丝端解离的速率常数降低，基本上通过防止丝解聚来稳定肌动蛋白丝。此外，发现鬼笔环肽可抑制 F-肌动蛋白的 ATP 水解活性。鬼笔环肽在细胞中的不同浓度下功能不同。当以低浓度引入细胞质时，鬼笔环肽将细胞质肌动蛋白的聚合程度较低的形式以及细丝蛋白募集到聚集的肌动蛋白聚合物的稳定“岛”中，但它不会干扰应力纤维，即微丝的粗束。

鬼笔环肽的特性是研究 F-肌动蛋白在细胞中分布的有用工具，方法是用荧光类似物标记鬼笔环肽并使用它们对肌动蛋白丝进行染色以进行光学显微镜检查。鬼笔环肽的荧光衍生物已被证明在定位活细胞或固定细胞中的肌动蛋白丝以及在体外观察单个肌动蛋白丝方面非常有用。荧光鬼笔环肽衍生物已被用作高分辨率肌动蛋白网络研究的重要工具。

准备工作解决方案：

艾美捷鬼笔环肽-iFluor 594偶联物工作溶液

将 1 µL 艾美捷鬼笔环肽-iFluor 594 偶联溶液加入 1 mL 含 1% BSA 的 PBS。

注意：鬼笔环肽结合物的储备溶液应分装并储存在-20°C。避光。

注意：不同的细胞类型可能会有不同的染色。应相应地制备鬼笔环肽结合物工作溶液的浓度。

艾美捷鬼笔环肽-iFluor 594偶联物 示例实验：

染色细胞

1.进行甲醛固定。将细胞与 PBS 中的 3.0–4.0% 甲醛在室温下孵育 10–30 分钟。

注意：避免使用任何含有甲醇的固定剂，因为甲醇会在固定过程中破坏肌动蛋白。优选的固定剂是不含甲醇的甲醛。

2.在 PBS 中冲洗固定细胞 2-3 次。

3.可选：将 PBS 中的 0.1% Triton X-100 添加到固定细胞中 3 到 5 分钟以增加渗透性。在 PBS 中冲洗细胞 2-3 次。

4.将 100 μL/孔（96 孔板）的 Phalloidin-iFluor™ 594 Conjugate 工作溶液加入固定的细胞中，并在室温下染色细胞 20 至 90 分钟。

5.用 PBS 轻轻冲洗细胞 2 到 3 次以去除多余的鬼笔环肽结合物，然后用 TRITC 或德州红滤光片组在显微镜下进行电镀、密封和成像。

图：用 4% 甲醛固定的 HeLa 细胞的荧光图像，然后用 Cell Navigator™ F-Actin Labeling Kit *Red Fluorescence* 在 Costar 黑色 96 孔板中染色。细胞分别用 艾美捷鬼笔环肽-iFluor 594（Cat#23122，红色）和细胞核染料 DAPI（Cat#17507，蓝色）标记。细胞内质网 (ER) 在固定前用 ER Green™（Cat#22635，绿色）染色。