Inducible knockout system诱导性敲除系统质粒构建--week 1 Gibson Assembly

关于inducible knockout system，原先花了超过12个小时看了一篇相关文献并做了PPT，结合所掌握的背景知识，对这个实验方案模模糊糊了解了一些。以下是我简单记录自己从零基础开始学习分子克隆基础实验技术的过程。

想要开始学习并能实施这样的实验内容，需要掌握以下：

背景知识学习：
Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记
FLP-FRT系统--诱导性基因编辑inducible gene editing
解剖式学习一个质粒结构--做知识的搬运工
Gibson Assembly 学习笔记--做知识的搬运工

还需要补充：（我并没有整理这部分资料写出来）
Tet-on/off系统
如何设计PCR扩增DNA片段的引物（使用SnapGene软件）

本周做的事情就是载体构建

准备工作

1. 供体质粒若干：用于vector提取，用于PCR扩增DNAfragment；
2. 常用的限制性内切酶；
3. 感受态细胞；
4. 质粒转化、扩增等相关基本技术和材料；
5. 胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等。

Step 1 准备所需载体+PCR扩增DNA片段

（1）通过酶切方式，将不需要的片段切下，通过凝胶电泳分离出所需的vector，并使用胶回收试剂盒回收vector。
这部分用到的protocol主要参考限制性内切酶说明书+胶回收试剂盒说明书。
（2）前期通过SnapGene上的Gibson Assembly工具事先算好质粒构建的路线方针（嘻嘻），所以引物是提前设计好了，并找了生物公司合成。找到含有目的DNA片段的质粒，使用Q5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增出目的片段，凝胶电泳胶回收该DNA片段。
这一步使用到的protocol，就是Gibson Assembly设计教程及Q5 PCR的protocol。

Step 2 Gibson Assembly实验

参照自己买的Gibson Assembly试剂盒的说明书即可~
https://international.neb.com/applications/cloning-and-synthetic-biology/dna-assembly-and-cloning/gibson-assembly

Gibson Assembly from NEB

Step 3 Gibson Assembly产物转化、扩增并提取质粒

（1）将Gibson Assembly转入感受态细胞中，复苏成功后涂带筛选功能（如抗生素抗性）的平板，12-16小时候挑克隆进行扩增12-16小时。
（2）取菌液200 μl，99摄氏度破裂15 min后，4000 rpm离心5 min后，取2 μl上清用作PCR模板，使用Step 1中第（2）步的DNA扩增引物进行PCR反应，检测是否已经插入该片段，此时使用Taq DNA聚合酶寄即可。
（3）菌液提取质粒之后，使用酶切实验验证是否插入相应DNA片段（好好挑酶切位点），琼脂糖凝胶电泳验证产物分子量大小。
这部分使用到的protocol：质粒转化、Taq DNA聚合酶PCR、质粒提取、酶切实验。

Step 4 测序验证。

最终还是要靠测序验证的。

不只是一步

有些质粒构建的过程比较复杂，不只是一次Gibson Assembly就可以的。有时候可能要结合Golden Gate之类的方法。

抽空写了20分钟，并没有回头检查错别字，敬请包涵，休息好了~继续干活去，加油！

（PS：为什么这么简单的一个推文，非要写出来？其实当我零基础的时候，我甚至不知道什么是质粒，所以这篇推文里面的几乎所有的实验还有背景知识都是现学现用的，所以我还是坚持把自己完成一个事情所需要做的所有的事情都相应记录下来，希望能对其他人有所帮助。尽管补充了理论知识，实际实验过程中还是会遇到非常多的细节问题，都是遇到一个解决一个的，前路且长，慢慢走吧。）