eccDNA: 杂乱无章或循规蹈矩？

什么是eccDNA？

染色体外环状 DNA (eccDNA) 是一种来自染色体的双链环状 DNA。它在序列、长度和起源上具有很强的异质性，并且普遍存在于癌细胞甚至正常体细胞中。尽管许多研究表明它在各种生理和病理过程中的潜在作用，包括衰老、端粒和 rDNA 维持、耐药性和肿瘤发生，但具体到 eccDNA实际发挥的功能--那仍旧是一个黑匣子 。最近，由于技术进步，越来越多的证据表明 eccDNA 通过调节癌基因的表达、染色体可及性、基因组复制、免疫反应和细胞通讯在癌症中发挥重要作用。

研究eccDNA的什么呢？

eccDNA是指一种来源于染色体却游离于其外的双链环状DNA。1965 年，Alix Bassel 和 Yasuo Hoota 首次使用电子显微镜观察了公猪精子中的 eccDNA。eccDNA 普遍存在于真核细胞中，并且已在酵母、植物、Oxytricha、非洲爪蟾、鸽子和人类细胞中鉴定到。它可以来自基因组中的任何地方，大小从数百个碱基对 (bp) 到几个兆碱基对 (Mb)。根据大小和来源，eccDNAs可分为线粒体DNAs（mtDNAs）、附加体（episomes）、双微体（DMs）（100kb∼3 Mb）、端粒环（t-circles）、小散在DNA（spcDNA）（100bp∼ 10 kb) 和 microDNA (100–400 bp)。 一些研究表明，附加体可以在癌细胞中聚合成 DMs，这表明一种类型的 eccDNA 可以通过聚合或片段化以及随后的再循环转化为其他类型的可能性。

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由于 eccDNA 的计数、组成、来源和表达模式在细胞和组织中具有显着的动态和多样性，因此表征 eccDNA 的功能和强调机制极具挑战性。许多关于 eccDNAs 的基本开放性问题仍未得到解答。例如，eccDNA 是细胞程序的副产品还是必不可少的参与者？eccDNA 的序列对其功能是否重要？eccDNAs 在癌症发生和发展中的作用是什么？

eccDNA的形成机制？

已经提出了几种 eccDNA 生物发生模型：

1）染色体碎裂模型：

染色体碎裂是染色体的灾难性破碎，随后以随机顺序进行大量基因组重排，导致受限基因组区域中复杂的基因组结构重排。由于“破碎”过程导致聚集的 DNA 双链断裂 (DSB)，随后是 DNA 修复或异常 DNA 复制，这使其成为生成 eccDNA 的完美环境；

2）附加体模型：

复制叉停滞可能导致复制叉塌陷，复制泡随后从染色体上脱落，转化为染色体外环状分子，称为附加体；

3）易位-切除-缺失-扩增模型：

在这个模型中，DNA 重排发生在染色体上的易位位点附近。易位断点附近的片段可以被扩增、删除和环化，从而导致 eccDNAs 的积累。

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包括同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）和微同源介导末端连接（MMEJ）在内的DNA损伤修复途径参与了microDNAs的形成。细胞缺乏 53BP1 和 XRCC4 促进规范-NHEJ (c-NHEJ)，导致形成更多的 microDNA。相反，NBS1、POLQ、RAD54、MLH1、MSH2、MSH3、FAN1和 NBS 的缺乏导致 microDNA 减少 。连接点两端的反向（非反向）重复序列为在 eccDNA 形成过程中初始化同源重组 (HR) 提供了完美的场所。此外，还发现 NHEJ 和 MMEJ 途径中的一些关键参与者，例如 DNA 连接酶 IV 和 III，有助于 eccDNA 的产生。此外，DNA 复制和转录也可作为 eccDNAs 形成的机制。例如，肌肉中转录最多的蛋白质编码基因titin (TTN) 具有最多的 eccDNAs 。相反，非编码基因区域与 eccDNA 频率的相关性较低。

人们普遍认为，eccDNA 的起源不限于基因组中的特定位点。然而，eccDNA的分布模式仍然存在争议。一些研究报告称，绝大多数 eccDNA 来源于重复元件；其他人则说其来源于热点基因元件，例如基因的 UTR、cpg岛和转录激活的染色质。最近的一项研究支持药物诱导的细胞凋亡细胞的均匀分布模型。尽管这些模式的驱动力仍然未知，但有理由推测 eccDNA 的起源可能是由不同细胞条件下 eccDNA 生成的机制决定的。

eccDNA的扩增（自我复制）

除了能自我扩增的以外，大部分的eccDNA都会被迅速降解。然而，有关eccDNA扩增的机制仍充满争议。例如一些研究表明，eccDNA 扩增依赖于 DNA 复制和有丝分裂。而其他人则说，当正在进行的复制被抑制剂阻断时或至没有任何 DNA 复制的情况下eccDNA 水平会增加。然而，尚不清楚这些 eccDNA 水平的增加是否是扩增引起。因此可以推测 eccDNA 可以独立于有丝分裂的方式扩增，因为它们中的许多没有常规 DNA 复制所需的复制起点（eccDNA是没有着丝粒的，在有丝分裂的细胞中按非孟德尔遗传的方式扩增，导致细胞eccDNA的不均衡累积）。

eccDNA的调控机制

eccDNA 可以通过不同的机制调节许多细胞过程：
1）含有全基因的 eccDNA 的生物发生可能导致基因拷贝数的增加并增强基因的转录；
2）通过与mRNA杂交形成R-loop来调节其翻译效率；
3）影响复制或有关转录机制的组分，导致无法复制或转录基因组 DNA，最终导致细胞生长停滞和死亡;
4）作为反式作用因子（如超级增强子），通过调节靶基因的表观遗传状态或可及性来调节基因表达；
5）作为细胞因子刺激免疫反应或介导细胞间通讯；
6）通过将 eccDNA 重新插入基因组 DNA 进行的遗传重排；
7）保护 ALT 细胞中的端粒。

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eccDNA的生理功能

eccDNA 在多种生理过程中发挥着重要作用，包括：
1）抗逆性和进化。在植物中，eccDNA 可以放大和传递农作物杂草中的除草剂抗性基因，从而导致草甘膦的快速抗性和适应性进化。此外，eccDNA 在秀丽隐杆线虫种系中被鉴定出来，可以作为遗传物质被后代遗传；
2）功能增强。在人类中，肌肉中转录最多的蛋白质编码基因 Titin (TTN) 具有最多的 eccDNAs，并暗示 eccDNA 可能有助于宿主细胞实现其功能。
3）促进老化。已发现 eccDNA 在旧细胞中积累并在酵母中诱导衰老。它还在抗衰老 SAM-R 小鼠的衰老过程中被放大，并与过早衰老和寿命缩短有关。积累的结果强调了 eccDNAs 在与年龄相关的中枢神经系统疾病中的作用，但仍然缺乏直接证据；
4）基因组稳定性维护。某些类型的 eccDNA 起源于端粒(t-circles）和着丝粒（主要的卫星重复），它们是维持基因组完整性的基本结构。特别是，t 环对于维持 ATL 细胞中的端粒至关重要；
5）免疫反应。由于不受染色质保护，eccDNA 可能成为活性自身免疫细胞的内源性抗原。最近，eccDNA 在触发先天免疫反应中的作用被发现。令人惊讶的是，该研究表明它是环状的，而不是对免疫反应激活至关重要的 eccDNA 序列。
6）细胞间通信。eccDNA 的高稳定性、高迁移率和自我复制能力使其成为细胞间信号转导和放大的完美信使。最近的研究证实，人类和小鼠细胞可以在体外有效地发射和感知 eccDNA（尤其是 microDNA）。此外，在外周血中检测到正常细胞和肿瘤细胞释放的 eccDNAs 。这些数据表明 eccDNA 对细胞之间的局部和远程信号转导有潜在作用。

eccDNA在癌症中的作用（ecDNA)

ecDNA 是指仅在肿瘤中检测到的大型 eccDNA。此外，DM是一种特殊类型的ecDNA，通常包含完整的癌基因或耐药基因，已在大多数人类肿瘤中检测到。ecDNA 作为癌基因和耐药基因的载体，使它们能够快速扩增，从而导致过度表达。例如，在 ecDNA 中发现了致癌基因 EGFR 和 c-MYC，相比于正常组织，癌症组织明显具有更大的扩增水平。在接受甲氨蝶呤 (MTX) 治疗的 SCLC（小细胞肺癌）患者的肿瘤细胞中，检测到大量含有二氢叶酸还原酶 (DHFR)（一种耐药基因）的 DM 被扩增和过表达。缺乏高阶染色质结构、抑制组蛋白修饰和绝缘子束缚使 ecDNA 比其基因组对应物获得更高的可及性，这可能促进启动子-增强子相互作用、转录初始化和额外表达。此外，最近的研究还表明，ecDNA/DMs 可以作为移动超级增强子来增强全基因组靶向基因的转录。此外，有丝分裂期间 ecDNA 的不平衡分离提供了一层额外的肿瘤异质性，最终导致肿瘤适应微环境压力和各种疗法，如放疗和化疗。这可能是具有 ecDNA 的肿瘤通常更具侵袭性的原因，这与较差的生存结果有关。

较小的 eccDNAs（例如 microDNAs）在癌症生物学中的作用仍然存在争议。由于它们通常太小而无法包含全长基因（miRNA除外），其转录产物是否对癌症进展有任何影响尚不清楚。然而，它们对于分子海绵化可能很重要。由于通常源自其亲本基因的 5'-UTR，microDNA 可能为相关转录因子提供额外的结合位点，因此，作为转录因子的海绵，间接控制基因表达和转录稳态。此外从垂死细胞中释放的 microDNA 可以显着诱导 I 型干扰素表达和先天免疫刺激反应。怀疑对癌细胞进行药物治疗可能会诱导细胞凋亡，同时产生 eccDNA 并随后显着改变肿瘤微环境。这项工作突出了microDNA在癌细胞耐药性中的潜在作用，为癌症免疫治疗提供了新的思路。

eccDNA研究方法

许多常规方法用于表征 eccDNAs 的序列、拷贝数、亚细胞定位和生物学功能。然而，这些方法通常提供的关于 eccDNA 序列的信息很少，并且不能提供整个环状DNA的全局视图。目前，下一代/第三代测序技术（如长读长测序（Nanopore和PacBio SMRT测序）和单细胞测序（SC-Seq））和改进的方法（如Circle-seq、4C-seq、PLAC- seq 和 ATAC-seq）为我们提供了革命性的工具，可以从多个角度以及单碱基对和单细胞分辨率研究环状DNA组。其中长读长测序与无 PCR eccDNA 纯化技术相结合大放异彩，为克服短读长测序在检测大 eccDNA 方面的局限性提供了一种有前途的解决方案，并提供了无偏的循环组学图谱。此外，我们推测 SC-Seq 可能是解码 eccDNA 分离规则以重建肿瘤进化历史的下一个主导技术。此外，最近已经提出了许多用于 eccDNAs 的生物信息学分析工具和数据库(ecSeg,AmpliconArchitec等），极大地促进了 eccDNA 研究的快速发展。然而，考虑到环状DNA组的极端复杂性，且关于eccDNA的数据，仍然非常有未来需要进行深入的研究来积累和注释eccDNA。

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参考文献：
Zuo S, Wang C, Li X, et al. Extrachromosomal Circular DNA (eccDNA): From Chaos to Function[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology, 2022: 3812.