文献阅读-FERONIA受体激酶通过调控ROS来调控自交不亲和

大家好，本次阅读的文献是近期发表在《current biology》上的《FERONIA receptor kinase-regulated reactive oxygen species mediate self-incompatibility in Brassica rapa》的一文，通讯作者是山东农业大学园艺学院的段巧红教授，近期来该课题组在FER受体激酶在生殖过程中的功能研究取得的一系列卓有成效的结果。

大多数芸苔科植物演化出自交不亲和(self-incompatibility, SI)的机制，以避免近交来产生杂交优势，例如我们熟知的 小肽SP11-受体SRK信号通路来调控自交不亲和，但是柱头是如何拒绝自身的花粉目前还未知。本文以大白菜为模型探究了柱头中的ROS对于SI的影响。

为了确定ROS是否参与大白菜的SI，在SI和CP（相容性花粉）授粉后不同时间点对大白菜柱头进行,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA)染色，可以发现SI时，柱头的ROS会上升，但是CP时，柱头会明显下降。通过与细胞壁的marker PI染色，发现在ROS主要定位在贴近质膜的胞质中。此外，利用其他两种ROS的探针：hydroxyphenyl fluorescein 和 dihydroethidium 也得到了类似的结果。

Stigmatic ROS increase after self-pollination and decrease after compatible-pollination

为了探讨自花授粉后柱头ROS增加的分子机制，他们抑制了SRK的表达来降低SP11-SRK信号通路来检测ROS，由于大白菜遗传转化非常困难，于是他们利用 antisense oligodeoxyribonucleotide(AS-ODN)技术来进行敲低，AS-BrSRK46(V)的施加成功降低SI反应。有趣的是SRK的敲低不仅降低了未授粉的柱头的ROS，而且抑制了自交时ROS的增加。

The increase of stigmatic ROS after self-pollination is S-haplotype specific

那么高水平的ROS是否是拒绝自身花粉的原因呢？这里作者采用了ROS 各种ROS的清除剂CuCl2, Tiron, KI, or sodium benzoate, 这些抑制剂均有效的抑制了柱头的ROS,并且以剂量依赖性的方式增加花粉管的穿出。（重点：活性氧清除剂在指定浓度下并没有抑制亲和花粉的生长，表明柱头和花粉活力没有受到影响）。因此这些结果明确地表明，柱头ROS的增加是排斥自身花粉的必要因素。为了进一步证实该观点，作者进行一个‘‘stigma transfer experiment’’实验，在施加自身花粉0-60min的柱头转入ROS的抑制剂中。花粉管的萌发数随着转移的时间而减少。有趣的是，他们还利用了黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶(X/XO)或是FeSO4 (Fe2+介导的Fenton反应)来在柱头产生ROS，对于相容性花粉也不能正常萌发。因此，ROS的增加对花粉具有非选择性的抑制作用。但是如果采用正常情况下混有两种不同类型的花粉分别授粉柱头一半时，发现相容性花粉仍能萌发，但是自交的不能萌发。因此推测当柱头遇到自交花粉粒和亲和花粉粒的混合时，诱导的ROS增加或减少会使附近的亲和花粉萌发，而自交花粉粒不萌发(如果能完全混合，其中一方有marker标记结果应该会非常有意思)。

High levels of stigmatic ROS are essential to reject self-pollen

植物中ROS主要由NADPH产生，那么这个过程是否有NADPH调控呢？通过施加NADPH的抑制剂diphenyleneiodonium chloride (DPI)，发现合适的浓度可以使得自交花粉管生长，因此ROS的产生应该主要是由NADPH所调控的。大白菜中一共有13个NADPH编码基因，其中BrRbohD1, BrRbohD2, BrRbohF, 和 BrRbohI主要在柱头表达。BrRbohF的敲低能够降低SI，此外BrRbohD1, BrRbohD2, 和 BrRbohl敲低也能降低柱头ROS的表达并且略降低SI，暗示着这些Rboh可能发挥着冗余地功能。为了进一步证明ROS调控SI在十字花科植物的保守性，他们还在萝卜和甘蓝的柱头上进行NADPH抑制剂的处理，发现也能降低ROS。

The involvement of NADPH-oxidase- dependent stigmatic ROS in the SI response of other Brassica specie

此外在用ROS降低的材料中，发现花粉管的生长长度明显增加，暗示着ROS的降低可能对于相容性花粉的萌发具有促进作用。在自交相容性的拟南芥的rbohd中，在授粉前后柱头均具有更低的ROS累积水平且花粉管萌发加快。因此RBOH酶作为关键酶，在CP时促进花粉萌发，但是SI时抑制。

那么什么调控了RBOH的酶活呢？在先前的研究中发现RBOH受到ROP的激活，通过抑制剂和敲低证明了ROP2调控并且通过互作验证了ROP8与RBOHF存在直接互作。

NADPH-oxidase-dependent ROS production during pollen-stigma interaction is mediated by Rac/Rop GTPases

由于FER在柱头上也有表达，FER是否也参与这个过程呢？在拟南芥中，突变体柱头ROS下降且短时间内花粉生长速度加快（李超 science表型），在大白菜中，敲低FER显著降低NADPH的表达以及ROS在柱头的累积，同样降低了ROS并降低了SI。因此，FER-Rac/Rop GTPase-Rboh信号通路对于SI以及维持未授粉柱头ROS的基本水平是必要的。

FERONIA-Rac/Rop signaling controls stigmatic ROS during pollen-stigma interaction

一个问题：SI和CP中FER是如何识别的，单独信号还是受到SP11-SRK的调控？