TITLE****：Multi-Omics and miRNA Interaction Joint Analysis Highlight New Insights Into Anthocyanin Biosynthesis in Peanuts（Arachis hypogaea L.）
译名：miRNA与多组学联合分析阐明花生花青素合成新机制
期刊：Frontiers in Plant Science
日期：2022年2月
下载链接：
https：//doi.org/10.3389/fpls.2022.818345
研究介绍
本研究选取具有粉色和紫色种皮的两个花生品种G110（G）和Z18-40（Z）进行多组学和miRNA靶基因互作联合分析。通过紫外-可见分光光度计（UV-5800，中国上海）测定，在开花后30天和45天，Z18-40的花青素含量比G110高7.49- 8.62倍。然后，在不同的比较组中共鉴定出14个与花青素生物合成相关的候选基因（R2≥0.80），其中有一个与HCT（羟基肉桂酰转移酶）生物合成相关的新基因Ah21440。此外，通过联合多组学分析，在G1_vs_G2、Z1_vs_Z2、G1_vs_Z1和G2_vs_Z2中仅鉴定出花青素3-O-葡萄糖苷（Kuromanin， pmb0550）为唯一的共同差异累积代谢物（DAM）。miRNA与转录组中DEGs的相关性分析显示，AhmiR2950、AhmiR398、AhmiR50和AhmiR51调控HCT和查尔酮生物合成相关候选基因（Ah21440、AhCHS、AhCHI）。最后，对14个候选基因和4个差异表达miRNA进行了定量实时荧光定量PCR（qRT -PCR）验证，其趋势与之前的转录组数据一致。研究结果为深入研究花生种皮花青素代谢机制提供了重要参考。
研究目的
花青素是植物的次生代谢产物，存在于27个开花植物科的72个属中，具有生理健康作用如抗衰老、抗突变、预防心血管疾病、保肝抗癌等，随着人们越来越关注健康问题，花青素生物合成因此成为研究人员高度研究的化合物。
本研究采用转录组-代谢组联合分析方法对双亲种皮进行花青素合成的差异表达基因（DEGs）研究，并分析miRNA靶基因的相互作用。结果有望为浓缩花青素花生品种的栽培提供有益的见解。有望为花生种皮花青素代谢机制的深入研究提供参考。
材料与方法
材料：
本研究选用高油酸（O：79.52%； L：5.48%； O/L：14.51%）Z18-40，由“G110 ×紫珍珠”杂交获得。G110粉种，高油酸（O：74.62%，L：5.48%；O/L：13.62）为母本，紫珍珠以紫色种皮和正常油酸（O：44.83%，L：35.17%；O/L：1.27）为父本。利用两个KASP标记A004807和A004808对F2后代进行鉴定，共66个aabb基因型的高油酸后代进行厌氧自花授粉，直到F7，产生了优势系Z18-40。Z18-40是花色苷含量高、油酸含量高的新品种之一。G110、Z1840于2020年5月在中国保定市黟县站分别种植，7-10月开花后贴标签。
方法：
1、外种皮****颜色值差异的测量
两个品种在30、35、40、45、50和55 DAF条件下的a、b和L值用比色仪（CR-10Plus，日本）测定，生物重复3次。使用SPSS26进行单因素方差分析，以30DAF为参考，根据下式计算色差（ΔE）的大小：
ΔE值0.00-0.25、0.25-4.00和>4.00分别被认为是理想的、可接受的和实质性的差异。花生切片，每片用0.5%香兰素溶液染色20分钟。然后用体视显微镜（XDL7000，中国）测量30和45 DAF时种皮颜色的变化。
2、转录组分析
在Illumina平台上测序前，采用五步法构建了12个互补cDNA文库（2个品种×2个周期×3个重复）然后利用HISAT2系统将高质量的序列与四倍体花生品种参考基因组2进行比较，同时记录两组样本的FPKM值，利用DESeq2计算比较差异表达的FPKM值（Fold Change， FC）和假发现率（FDR）。以| log2FC|≥1和FDR < 0.05为阈值筛选差异表达基因（DEGs）。
3、代谢组分析
为评价G110和Z18-40的种皮花青素含量，采用Wrolstad et al.的方法进行含量测定和改进。总花青素含量用减去吸光度/鲜重来计算。采用液相色谱-质谱联用法（LC-MS/MS）对不同种皮进行定性和定量测定。代谢物的结构分析基于HMDB、MoToDB和METLIN等现有质谱公共数据库进行。空间投影重要性（VIP）> 1，p < 0.05 是筛选DAM的阈值。
4、miRNA****s-靶基因的相互作用
将所有独特的序列与GeneBank tabase进行比较以识别miRNAs。使用BLAST搜索miRNA数据库miRBase release 20确定已知miRNA。未对任何类别进行注释的Reads使用miRNA预测程序mireap预测新的miRNA。并使用TPM（Transcripts Per Million）算法对表达式量进行规范化。采用edgeR软件进行miRNAs差异表达分析，以| log2FC|≥1和FDR < 0.05为筛选标准识别DEGs。通过clusterProfiler对样本组间差异表达的靶基因进行预测和富集分析，通过富集因子分析通路的富集程度，通过Fisher精确检验计算富集显著性。
5、qRT-PCR分析
（1）qRT-PCR分析差异表达基因
用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测候选基因的转录水平。采用高通量测序的相同RNA样本进行qRT-PCR。利用Premier 5.0软件设计引物，分别进行3次生物重复和3次技术重复实验。以ACT7作为内参照基因，通过2−11Ct分析qRT-PCR结果。t检验用于比较基因表达的差异。
（2）qRT-PCR分析miRNA
实时荧光定量PCR验证候选miRNA的测序水平。qRT-PCR结果分析方法与上述方法相同。
结果
图1. G110与Z18-40植物学表型的观察与鉴定图
图（A）为G110（G）与Z18-40（Z）整株植物的色差比较，左侧G110，右侧Z18-40，比例尺为1cm。图（B）为G和Z的茎、果针、花的色差比较，比例尺为2cm。图（C，D）为六个生育期G和Z之间的种皮颜色变化趋势，比例尺为1 cm。另外，G和Z的“ΔE”值是在6个时期内确定的，绿色虚线表示ΔE= 4。红色箭头分别为G和Z中30DAF和45DAF的种皮，用立体显微镜放大20倍观察的情况。
图2. 花青素DEGs的筛选与富集分析。
（A）花生品系中G1_vs_G2、Z1_vs_Z2、G1_vs_Z1和G2_vs_Z2的DEGs重叠的维恩图。颜色不重叠部分的数字代表单一比较组的DEGs。颜色重叠部分的数字表示不同对比组共享的DEGs。图（B）为上述4个比较组之间KEGG通路富集分析，横坐标表示富集因子，纵坐标表示富集通路，圆的大小表示DEGs的个数，每个圆的颜色表示q值。图（C）由四个圆圈组成。圆圈1（Cy1，最外圆圈）表示7个GO 2级分类，分别定位到四个比较组。圆圈2（Cy2，次外圆圈）表示与GO 2级分类相对应的DEG的数量。数字下面矩形的颜色表示q值（-log10）。圆圈3（Cy3，次内圆圈）是指GO 2级分类对应的上调和下调基因数量。圆圈4（Cy4，最内圆圈）表示GO 2级分类的富集范围，包括生物过程和分子功能。绿色圆线表示富集因子= 1。
图3. 对DAM（差异积累代谢物）表达调控及花青素含量差异分析。
图（A）为DAMs的表达调控，横坐标表示对比组，纵坐标表示DAMs，圆圈大小表示abs（log2FC），红色表示表达上调，蓝色表示表达下调。图（B）显示花青素含量的差异分析，横坐标表示品种和时期。G1、G2分别代表G110的30DAF、45DAF，Z1、Z2分别代表Z18-40的30DAF、45DAF。纵坐标表示OD值（OD/g）。“ns”表示差异无统计学意义（p > 0.05），“***”表示差异有统计学意义（p < 0.001）。
图4. DAMs与候选DEGs的相关分析。黄色椭圆上方的pmb0550、pme0442和pmf0203分别为花青素3-o-葡萄糖苷（Kuromanin）、飞燕草素和芍药苷3-o-葡萄糖苷氯化物。矩形上方标注了DEGs。红色、蓝色、浅红色和浅蓝色矩形分别表示G1_vs_G2、Z1_vs_Z2、G1_vs_Z1和G2_vs_Z2。红色实线和蓝色虚线分别表示DEGs和DAMs之间正相关和负相关，其中为相关值。
图5. miRNAs与靶基因相互作用分析。
图（A）中的5个柱状图由红色、蓝色、浅红色和浅蓝色组成，分别代表G1_vs_G2、Z1_vs_Z2、G1_vs_Z1和G2_vs_Z2，上面分别是靶基因的数量。横坐标表示KEGG通路，分别命名为类黄酮合成（ko00941）、苯丙氨酸代谢（ko00360）、色氨酸合成（ko00400）、异黄酮合成（ko00943）和植物激素信号转导（ko04075）。纵坐标表示靶基因的数量。图（B）显示了上述四个比较组中差异表达miRNAs的调控情况。横坐标表示比较组，纵坐标表示差异表达的miRNAs。红色表示表达上调，蓝色表示表达下调，白色表示无差异表达。图（C）显示miRNA-靶基因的相互作用。左边是差异表达的miRNAs，miRNAs旁边的数字表示对应的靶基因的数量。右边是靶基因的ko_names，ko_names旁边的数字表示miRNAs的数量。
图6. qRT-PCR验证候选DEGs和miRNAs。
（A）显示分别在G1_vs_G2、Z1_vs_Z2、G1_vs_Z1和G2_vs_Z2中对候选DEGs进行qRT-PCR验证。横坐标表示候选DEGs，纵坐标表示相对表达式。“”表示p < 0.05，“”表示p < 0.01，“”表示p < 0.001。（B）显示了通过qRT-PCR验证差异表达的miRNAs。横坐标表示候选miRNAs，纵坐标表示相对表达。“”表示p < 0.05，“”表示p < 0.01，“**”表示p < 0.001。（A）中与（B）中miRNAs相互作用关系的靶基因用相同的颜色标记。
图7. 花青素生物合成miRNA与靶基因相互作用的机制图。
图中，带有淡黄色的矩形代表代谢物，代谢物之间的淡红色箭头代表首选途径，而淡蓝色箭头表示非首选途径。虚线矩形表示miRNAs-DEGs相互作用。箭头旁边的绿色标签表示DEGs，灰色椭圆标记出DEGs对应的miRNA，用浅灰色箭头将两者连接起来，miRNA下方表示调控。粉色和紫色的“〇”分别表示G110和Z18-40的30 DAF。“□”带粉色和紫色分别表示G110和Z18-40的45 DAF。“+”、“-”、“=”表示左侧比较中DEGs与miRNA之间存在正、负、无调控关系。红色叉表示代谢物或基因中没有调控表达。
结论
植物学表型结果表明，种皮颜色随发育时期逐渐变暗。45 DAF是种皮颜色变化的关键时期。对候选结构基因和代谢物的调控发现，AhFLS在G1_vs_G2中表达下调，而AhDFR无差异表达。表型结果表明，AhLODX是决定花青素含量的关键基因。代谢组学分析结果显示，AhLAR在Z2中的高表达增加了其原花青素含量。在本研究中，G1_vs_Z1和G2_vs_Z2中AhANR表达下调，导致Z1中原花青素含量下降，G2_vs_Z2中原花青素B2和B3均表达下调，原花青素A1表达上调，提示AhANR可能是调控原花青素B2和B3的关键基因。miRNA与靶基因的相互作用发现，所有9个miRNAs都与靶基因有不同程度的相互作用，因此，结果表明miRNAs能够调节以花青素为基础的抗非生物胁迫。紫色种皮中参与调控的miRNAs明显比粉色种皮丰富。结果表明，种皮颜色与抗非生物胁迫能力存在潜在的正相关性。miR398通过AP2和SPL3靶基因参与调控，而miR398_x则参与F3’H靶基因的调控。结合转录组数据，发现AhmiR2950在花青素含量低的花生中呈负调控，在花青素含量高的花生中呈正调控，调控期往往在发育早期。这些结果表明，miRNA的调控模式可能因生殖期的种类和进展而不同。
END