DAY7-孟思博

测序相关知识集中充电

测序过程和原理

优秀的参考文章：《测序的世界》：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2

第一代测序技术-Sanger法测序

聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来，测序分为四个反应容器，每个容器加入四种核糖核苷酸dNTP和某一种双脱氧核糖核苷酸ddNTP，DNA合成的时候就会随机的引入这种双脱氧核糖核苷酸，从而不能继续合成，这样DNA片段就到这个位置终止了。进而，四个反应容器就合成了长度不同的片段，并且终止的位置肯定是加入的双脱氧核糖核苷酸ddNTP。我们通过电泳，就可以将四条泳道的DNA产物按照大小分开，根据模板DNA合成的序列就可以从下向上一次读出。第一代测序平台也是基于Sanger法发展起来的，不过更加智能，功能更加多样化。虽然相比二代测序，一代测序通量较低，但是其准确度是非常高的，许多文献将Sanger测序结果当做黄金标准。

第二代测序技术-大规模平行测序

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。比如对无基因组物种进行从头测序（de novo sequencing），为后续研究和分子育种奠定基础；对有基因组的物种，进行全基因组重测序（resequencing），检测SNP。在转录组水平上开展小RNA测序（small RNA sequencing），从而发现新的microRNA分子。转录组测序与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。
大规模平行测序平台的出现使测序费用急剧降低，测序通量大大增加。市面上出现了很多二代测序（NGS；next generation sequencing）仪器，每种仪器产出的数据格式不同，测序流程也略有不同，不同平台有不同的优势。例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。454测序平台产出数据reads较长 (800 -1000 bp) 较准确，所以对于拼接基因组具有一定优势，但通量较低，成本偏高；Illumina平台产出reads中等（100-150 bp）通量最高，价格最低，但测序质量较差；SOLiD产出数据reads较短（50 bp）。因此Illumina平台在竞争中占有大量的市场份额。 Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上，通过技术创新，用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP，当DNA聚合酶合成互补链时，每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光，根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理，从而获得待测DNA的序列信息。

第三代测序技术-单分子测序技术

第三代测序技术又被为"Single Molecule Real Time (SMRT™) DNA Sequencing"（单分子实时DNA测序技术），该方法基于纳米孔的单分子读取技术，不需要扩增即可快速读取序列，解决了初始模板DNA扩增的偏好性问题。第三代测序技术以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术为标志，不需要经过PCR扩增，超长读长，可达二代测序的100倍以上，实现了对每一条DNA分子的单独测序。错误率比二代要高，达到10-15%。
三代测序技术存在两个关键技术：1) 零模波导孔，这使得测序位点周围大量游离的荧光标记碱基与真实反应信号区别出来。2）荧光标记位点，二代测序都标记在5’端甲基上，这是NGS的测序读长仅能达到100多bp到200 bp的一个原因。而三代测序是标记到3’端磷酸键上，这样每一次加入一个核苷酸，标记基团都会水解下来，不影响之后的聚合反应。

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附注：文章《测序的世界》：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2需要仔细阅读理解。

都有哪些类型的测序

参考阅读：生信小白第6天-初涉测序（这一篇可以初步理解测序历史，也就是一二三代测序，以及什么是高通量测序）生信小白第8天 名词结构化（这一篇从研究对象上给高通量测序分类）
测序技术原理及常用数据格式简介（看前半部分）
DNA 测序技术的发展：第三代测序法（专业的介绍，看不懂先收藏）
测序发展史：150年的风雨历程（这个可以不整理，但这是我看过写的最好的测序史）
搜狗微信 搜索：【陈巍学基因】视频1 讲的挺好的

思维导图：

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