项目文章 | 细菌基因组测序助力艰难梭菌研究再攀高峰

文章题目：Independent Microevolution Mediated by Mobile Genetic Elements of Individual Clostridium difficile Isolates from Clade 4 Revealed by WholeGenome Sequencing

基于全基因组的可移动元件分析揭示进化支 4 艰难梭菌的独立微进化

文章杂志：mSystem

影响因子：7.324

分析方法：Denovo、MLST分析、MGEs分析、耐药基因分析、抗菌药物试验

研究思路：

研究结果

一. 进化支4 基因组特征和种群结构

分离得到的 37 株艰难梭菌分离株的基因组范围从 3.9 Mb 到 4.3 Mb。进化支 4 的种群结构与毒素定义的组有很好的相关性，与地理分布没有明显相关性。RT017 有两个截然不同的亚系，ST37 和 ST81，每个 ST 簇高度保守。在 ST37 簇中，虽然 ZR18 与其他 ST37 分离株相比表现出明显的差异，在随后的分析中，我们在基因组水平上 探讨了这些差异的原因。ST332 是发现的一种新的 ST，具有一个独特的阳性 tcdA 基因， 通过系统进化树分析可以看出其形成一个单态，而且两个非产毒分离株（ST109 和 ST39）也以单态分布。 

图1 种群结构和菌株 PaLoc 单核苷酸多态性    

二. 进化支 4 中 MGEs 的遗传多样性（转座子、前噬菌体、CRISPRs和质粒）

通过与参考基因组比较，确定了几个转座子(Tns)和共轭转座子（CTns），包括CTn5、Tn4453a/b、Tn5397、Tn5398、Tn6194、Tn916，以及含有与CTn2和CTn7同源区域的新假设转座子，并对其进行共线性分析。本研究在37株分离菌株中都鉴定出不同数量的前噬菌体，共预测到 497 个前噬菌体，鉴定出464个CRISPR阵列，16个潜在质粒序列，其覆盖率几乎为100%，并发现其含有重要的抗菌耐药基因（aadE、aad9、ermB、tetM、tetS 和 tetO）。

图2 CTn7、Tn4453a/b、Tn5397、Tn5398 在分离株中的表达及比较    

三. 耐药性基因及相关的抗菌药物敏感性

本研究通过 ARDB 和 CARD 数据库共鉴定了 60个 耐药基因，这些耐药性基因属于以下抗菌类：氟喹诺酮类、β-内酰胺类抗生素、大环内酯类、氨基霉素、利福平、糖肽、四环素、大环内酯-林可沙胺-链球菌素（MLS）、氯霉素、甲氧苄啶、链霉素、氨基糖苷、杆菌肽、脂肽。

图3 通过 CARD 和 ARDB 数据库预测 37 株艰难梭菌的耐药基因    

四. 耐药基因的全基因组关联分析

根据分析得到抗菌药物敏感性与基因型没有直接的相关性，为了探索其他可能导致耐药性的位点，本研究对与 CHL、MFX、RIF 耐药性显著相关的 SNP 进行了全基因组关联分析，分析发现与 CHL 耐药性相关的三个显著 SNP 位于基因间遗传区域 IGS 内，可能在细胞功能的甲基化和调控中发挥作用；与 MFX 耐药性相关的三个显著的非同义 SNP 分别在编码肌苷尿苷核苷水解酶家族蛋白和 ABC 转运蛋白的基因和 gyrA 基因中检测到，除了 GZ11 和 GZ28 ，所有 MFX 耐药性分离株，在 gyrA 中显示点突变（Thr-IIe），只有 1 株 MFX 敏感菌株 ZR66 在 gyrA 中携带 Thr-IIe 突变；通过 GWAS 分析鉴定出 4 个与 RIF 耐药性显著相关的显著 SNP。

图4 利用 treeWAS 软件对 37 株艰难梭菌进行全基因组耐药性分析  

本文亮点

本文主要研究来自进化支 4 的 37 株艰难梭状芽孢杆菌，ST332 是本文发现的一种新的 ST，具有一个独特的阳性 tcdA 基因；同时发现新的转座子原件，对其他典型转座子的共线比较研究，对前噬菌体、CRISPRs、质粒以及这些移动元件的耐药性进行详细研究；为了探索其他可能导致耐药性的位点，进行了全基因组关联研究（GWAS）分析，主要研究与 CHL、MFX、RIF 耐药性显著相关的 SNP；本研究为深入了解进化支 4 的基因组重构机制提供了重要的新视角，并为鉴定和追踪亲缘关系密切的分离株的起源提供了一种新方法。

细菌框架图研究的优势如下：

1. 框架图组装

2. 毒力基因&转座元件全息性挖掘

3. 基因组组分分析，编码基因、非编码基因全面了解

4. 数据库注释分析，发现宿主互作获得机制和耐药机制

5. 比较基因组分析病原基因的获得与扩散

6. MLST分析，揭示病原菌进化策略更多分析内容

参考文献：

[1] Yuan Wu, Chen Liu, Wen-Ge Li,et al. Independent Microevolution Mediated by Mobile Genetic Elements of Individual Clostridium difficile Isolates from Clade 4 Revealed by Whole-Genome Sequencing. mSystem,2019,4(2) e00252-18.