从零开始学PCR技术（二）：Taq DNA酶

PCR 技术改变了现代分子生物学，而 Taq DNA 聚合酶改变了 PCR。

1986 年，Mullis 发明了 PCR 技术，当时使用的是大肠杆菌聚合酶 I（Klenow），而这个酶是不耐热的，在反应体系温度升高使 DNA 变性的过程中会失去活性，因而每次循环都要加入新的聚合酶，操作十分麻烦，不能做到无人值守，成本也很高。

1988 年，Saiki 等将 Taq DNA 聚合酶应用于 PCR 技术，成功完成了 DNA 的自动扩增。Taq DNA 聚合酶对于 PCR 的应用有里程碑的意义，PCR 循环包括变性（90 °C 左右）、退火（50°C 左右）、延伸（70°C 左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受 90℃ 以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使 PCR 技术变得非常简捷。同时也大大降低了成本，PCR 技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

一、TAQ DNA 聚合酶的来源

Taq DNA 聚合酶是从一种叫做水生栖热菌（Thermus aquaticus）的嗜热细菌中分离出来的（Chien, 1976），这种细菌最初是从美国黄石国家森林公园的火山温泉中分离得到的，生长在 70-75℃ 极富矿物质的高温环境中（Brock, 1969）。Taq DNA 聚合酶具有极高的热稳定性，或许能够承受 PCR 的热变性步骤。1988 年，Saiki 等将 Taq DNA 聚合酶用于体外 PCR 扩增，不但实现了 PCR 自动化，还因为提高了退火和延伸温度而提高了产物特异性。这个研究鼓励了更多的技术人员使用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR，1989 年，Lawyer 等利用特异性探针从 Taq DNA 聚合酶基因文库中钓取了 Taq DNA 聚合酶全长基因，最终得到一个 2499bp 的编码序列，GC%高达 68%，他们将该基因克隆到大肠杆菌中，通过诱导表达和分离纯化得到纯的 Taq DNA 聚合酶。

二、TAQ DNA 聚合酶的结构与功能

Taq DNA 聚合酶属于聚合酶家族 A，是一个单体酶，它与大肠杆菌聚合酶 I（pol I）具有很高的结构相似性。1995 年，Kim 等公布了 Taq DNA 聚合酶的晶体结构，为解释其耐热性、催化活性及分子改造奠定了基础，下面将其结构特点罗列如下：

Taq DNA聚合酶的三维结构

① Taq DNA 聚合酶包括三个结构域，1-291：5'-3'外切核酸酶结构域，292-423：该结构域对应于 pol I 的 3'-5'外切酶结构域，两者虽然具有结构相似性但无序列相似性，因此 Taq DNA 聚合酶不具有 3'-5'外切活性，424-832：5'-3'聚合活性结构域。

② 5'-3'外切结构域是一个功能完整的独立结构域，该结构域的缺失不会使 Taq 丧失聚合活性，但对酶的催化性能有一些影响。Barnes（Barnes, 1992）构建了一个 N 端 236aa 缺失的 Taq 突变体，发现仍具有完整的聚合活性，且保真性有所提高。Lawyer 等（Lawyer, 1993）发现 N 端 289aa 缺失的大片段耐热性比全长酶更高，且盐离子耐受能力也提高了，但持续合成活性降低十倍。Merkens 等（Merkens, 1995）认为 Klentaq 持续合成能力的下降与 5'-3'外切结构域结合 DNA 有关，结合作用阻止了酶与 DNA 底物的彻底解离，后来很多研究人员也支持这一观点。此外，5'-3'结构域还对 Taq DNA 聚合酶的底物特异性有很大影响，5'-3'结构域删除片段对引物 3’端错配敏感性显著下降，对 ddNTP 的掺入能力增强。从三维结构上看外切结构域与聚合结构域距离很远（大于 70Å），很难理解它是如何与聚合结构域协作的，Kim 等也无法解释这个现象，他们推测 5'-3'外切结构域在溶液中的位置与晶体中不同，要更接近聚合结构域。

③ Taq DNA 聚合酶 3'-5'外切酶结构域比 pol I 短，缺少 4 个长度 8-27aa 的 loop 结构，并且 pol I 中担负金属离子结合的关键残基 D424、D501、D355、E357 在 Taq 中被替换为 L356、R405、G308、V310，酸性残基上的羧基能够与金属离子形成离子键，被替换后无法再与金属离子结合，Kim 等推测这是 Taq DNA 聚合酶失去 3'-5'外切酶活性的主要原因。

④ 5'-3'聚合活性结构域像一只右手，包括拇指(Thumb)、手掌(Palm)、手指(Fingers)结构，催化活性位点是 Asp610、Asp785 和 Glu786 位于 Palm 结构域中，手指结构中的 O-α 螺旋对底物特异性有重要作用，拇指结构中的 I-α 螺旋也和底物结合密切相关。

（Eom S H, 1996）Klentaq1-DNA复合物结构

三、TAQ DNA 聚合酶的特点

Taq DNA 聚合酶基因全长 2496 个碱基，编码 832 个氨基酸，分子量 94kD，预测的等电点约为 6.0，理论总平均亲水指数为-0.282。现将其酶学特点罗列如下：

① 良好的耐热型，最适催化温度在 75-80℃，95℃ 半小时后仍保留 50%以上的活性。Taq DNA 聚合酶是 Mg2+依赖型聚合酶，最适浓度范围是 2-4mM。Taq DNA 聚合酶还需要单价阳离子，在 10-55 mM KCl 中具有最大活性。有研究认为 Na+会抑制聚合酶活性，但有些研究中聚合酶在 Na+环境中也能够正常扩增。

② 5'-3'聚合活性，该特性对温度具有较高的敏感性，70℃ 时，Taq DNA 聚合酶能够以 60nt/s 的速率聚合 DNA 链，55℃ 时降为 24nt/s，37℃ 时为 1.5nt/s，22℃ 时基本停止扩增（Innis, 1988）。

③ 5'-3'外切核酸酶活性，Taq DNA 聚合酶是少数具有这一活性的 DNA 聚合酶之一。1991 年，Holland 等（Holland, 1991）利用 Taq DNA 聚合酶的 5'-3'外切活性切除 5’端放射性标记的 DNA 探针，通过放射性信号的变化，实现 PCR 产物的特异性检测。这一研究，为 qPCR 技术的发展奠定了基础，从此，Taq DNA 聚合酶也成了探针法 qPCR 技术的指定聚合酶。

④ 部分 PCR 产物 3’末端加 A，1988 年，Clark 等发现 Taq DNA 聚合酶会在新生链的 3’末端添加无模板核苷酸，这一特征使 Taq DNA 聚合酶的 PCR 产物能够直接用于 TA 克隆。但是实际应用时，情况要复杂得多， 1993 年，Hu 等报道了 8 种聚合酶 3’末端延伸的情况，发现 Taq DNA 聚合酶在 PCR 产物的 3’末端添加 A 或其它碱基。1996 年，Magnuson 等系统性研究了 Taq DNA 聚合酶 3’末端加 A 的概率，发现 3’末端加 A 并不高，与反向引物 5’端碱基种类密切相关，他们还指出这种不完全的碱基添加不利于在等位基因分型和 TA 克隆。

⑤ 无 3'-5'校正活性，虽然 Taq DNA 聚合酶与大肠杆菌聚合酶 I 有很高的结构相似性（包括 3’-5’外切核酸酶结构域），但它缺乏 3'-5'外切核酸酶活性，这降低了其在 PCR 扩增中的忠实性。关于 Taq DNA 聚合酶的错误率，不同的报道差异很大，Tindall 等（Tindall, 1988）测定的突变率为 1/9000，Cline 等（Cline, 1996）测定的突变率为 8.0±3.9×10-6。这种差异的原因有两个：一、测试方法不同，比如 lacZα 和 lacI，二、酶纯度和实验条件有差异。抛开这些错误率数据，实事求是的讲，我使用 Taq DNA 聚合酶多年，用于一般性扩增保真性还可以，一般 1-2.5kb 的目标片段，挑取两个克隆基本能得到正确的克隆。用于困难模板扩增时，错误率较高，挑取 4-6 个克隆子基本也能得到正确克隆。

(上述所列的酶的催化性能参数，在不同的研究中是有较大变化，因为可能使用的酶纯度不同，或者使用的 buffer 不同，模板、引物、仪器、反应体系甚至 PCR 管壁的薄厚都会导致 PCR 表现的差异。这些数据只是一个参考，实际使用中应以试验结果为准。)

四、TAQ DNA 聚合酶的应用

Taq DNA 聚合酶发现了几十年，不但没有被取代，反而在分子生物学领域具有越来越广泛的应用。这一方面依赖于它自身的功能和特点，另一方面也依赖于研究人员对其不断地改造。通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术，Taq DNA 聚合酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体，拓宽了酶的应用范围。下面是 Taq DNA 的一些应用领域。

• 热循环 PCR

• 易错 PCR

• 热启动 PCR

• 位点特异性 PCR（SNP 检测）

• qPCR（Taqman 法）

• TA 克隆

• Sanger 测序

• 二代测序

五、总结

Taq DNA 聚合酶已经被改造成了各种类型以适用于不同的应用领域。在这里我们考虑它对靶向扩增子测序的影响。

• PCR 错误的影响。由于 Taq DNA 聚合酶无 3'-5'校正活性，因此在 PCR 延伸过程中可能发生错误，导致碱基突变。但这种错误率低于千分之一,而扩增子大小通常只有几十到几百 bp。因此 PCR 错误的影响是很少的。

• 末端加 A 的影响。事实上 Taq DNA 聚合酶不只会向 PCR 产物末端加 A，还会加其他碱基，这与反向引物 5’端碱基种类密切相关。这在实验和生信分析过程中需要注意。

PCR 技术系列文章更新计划：

从零开始学 PCR 技术（一）：PCR 技术简介

从零开始学 PCR 技术（二）：Taq DNA 聚合酶

从零开始学 PCR 技术（三）：PCR 引物设计

从零开始学 PCR 技术（四）：常见问题

从零开始学 PCR 技术（五）：试验污染

从零开始学 PCR 技术（六）：多重 PCR 的应用

参考资料

[1]

Taq DNA 聚合酶的应用与改造历程: https://www.jianshu.com/p/a6d919a81b03

[2]

Taq+DNA 聚合酶的改造及应用: https://wenku.baidu.com/view/fb44d519f524ccbff0218419.html

[3]

百度百科：Taq 酶: https://baike.baidu.com/item/Taq%E9%85%B6/9237929?fr=aladdin

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