m6A原始数据识别差异甲基化——使用RADAR分析MeRIP-seq数据

Step1：原始数据的准备

从EMBL数据库根据SRR号下载SRAxxxxxxx.fastq.gz文件（有的是单端测序，有的是双末端测序）

EMBL数据库网站连接：https://www.ebi.ac.uk/ebisearch/error.ebi

数据展示：双末端：SRR7763560_1.fastq.gz  SRR7763560_2.fastq.gz；

                    单末端：SRR9029562.fastq.gz

数据下载linux命令：1.wget  数据的下载连接

                快速下载：2.ascp-QT-l20m-P33001-i /home/wangi/anaconda2/etc/asperaweb_id_dsa.openssh [email protected]:/vol1/fastq/SRR110/000/SRR1104940/SRR1104940.fastq.gz /home/wanghongli/histone/sheet46/GSE53938/SRR1104940.fastq.gz

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Step2：比对，利用hisat2讲原始数据比对到参考基因组 

1.hisat2下载安装

参考此链接：https://www.jianshu.com/p/2b41765358bc

2.构建hisat2的索引

需要先下载hg38参考基因组，下载hg38.fa.gz文件

文件下载地址：http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.fa.gz，下载解压

索引构建命令：hisat2-build -p 8 hg38.fa hg38 

大概耗时半个小时，需耐心等待

3.hisat2 比对命令,生成sam文件

双末端：

hisat2 -p 16 -t -x /hisat2索引所在的文件路径/hg38 -1 SRR7763560_1.fastq.gz -2 SRR7763560_2.fastq.gz -S SRR7763560.sam

单末端：

hisat2 -p 16 -t -x /hisat2索引所在的文件路径/hg38 -U SRR9029562.fastq.gz -S SRR9029562.sam

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Step3：

1.利用samtools将sam文件转换为bam文件

命令：samtools view -bS SRAxxxxxx.sam > SRAxxxxxx.bam

2.去除低质量的比对（MAPQ<30）

命令：samtools view -b -q 30 SRAxxxxxx.bam > SRAxxxxxx.q30.bam

3.利用samtools sort  bam文件得到sort.bam文件，用于接下来的处理

命令：samtools sort SRAxxxxxx.q30.bam -o SRAxxxxxx.sort.bam

4.去除duplication

命令：samtools rmdup -s SRAxxxxxx.sort.bam SRAxxxxxx.rmdup.bam

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Step4：利用RADAR方法识别差异甲基化区域

详细参考：https://scottzijiezhang.github.io/RADARmanual/workflow.html#1quick_start

1.将获得SRAxxxxxx.sort.bam重新命名：

如果是intput数据，则重命名为ctrlX.intput.bam【control组】/cX.intput.bam【case组】，如果是IP数据则重名为：ctrlX.m6A.bam【control组】/cX.intput.bam【case组】，注意。这里input.bam和m6A.bam中的X是一致的，因为他们是配对的。

补充：m6A甲基化数据展示：分为control组和case组，每一条数据都有配对的IP和input数据，所以重命名时要很好的区分IP和input数据同时还要区分control和case

2.差异分析，需要使用R语言

需要下载hg38对应的注释文件：

下载地址：ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_32/gencode.v32.annotation.gtf.gz

Rcode:

if (!requireNamespace("BiocManager", quietly = TRUE))

  install.packages("BiocManager")

BiocManager::install("devtools")

library(devtools)

install_github("RADAR")

library(RADAR)

radar <- countReads(

samplenames = c("ctrl1","ctrl2","ctrl3","c1","c2","c3"),

  gtf = "/注释文件所在文件路径/gencode.v32.annotation.gtf",

  bamFolder = "bam文件所在的文件路径",

   modification = "m6A",

    outputDir = "文件输出路径",

     threads = 10

)

radar <- normalizeLibrary( radar )

radar <- adjustExprLevel( radar )

variable(radar) <- data.frame( Group = c("Ctl","Ctl","Ctl","Case"，"Case"，"Case"，) )

radar <- filterBins( radar ,minCountsCutOff = 15)

radar <- diffIP_parallel(radar,thread = 10)

radar <- reportResult( radar, cutoff = 0.1, Beta_cutoff = 0.5 )

res <- results( radar )

write.table(res,file='/home/wanghongli/m6adata/GSE87190/MA9.3ITD/0911_diff.xls',sep='\t',quote=F)

samtools view -b -q 30 $i.bam > $i.q30.bam