RNA-seq：DEseq2归一化

主要能解决以下2个问题：

①测序深度/文库大小导致的差异

②文库补偿导致的差异

DESeq2均一化步骤：

step1：以原有reads数目取log2/10/e为底的对数

             sample#1       sample#2      sample#3

gene1                0                     10                  4

gene2                 2                      6                12

gene3                33                   55              200

       log(sample#1)     log(sample#2)   log(sample#3)

gene1            -Inf                     2.3                 1.4

gene2             0.7                     1.8                  2.5

gene3             3.5                     4.0                 5.3

step2 :求所有样本中单个基因的几何平均数

在这一步中，对上一步已经算出来的同一个基因对数值在所有样本中取均值，这种方法求出来的值称为几何平均数Geometric Averages。

       log(sample#1)     log(sample#2)   log(sample#3)     Geometric Averages

gene1            -Inf                     2.3                 1.4                     -Inf

gene2             0.7                     1.8                  2.5                    1.7

gene3             3.5                     4.0                  5.3                    4.3

这样做的原因是降低异常值对均一化的影响，以Gene3为例，原始reads中分别为33、55、200，而200明显是一个异常值，所直接按照reads计算均值，结果为96。几何平均数求值为4.3，转化为reads数对应的数值即为e的4.3次方，结果为73.7,相对96来说，这个均值受异常值影响更小。

step3：去除Infinity

在这一步中，将第二步计算出含Inf的基因剔除掉，也就是将样本中reads数为0的基因剔除。从理论上来将，保留下来的是在不同样本/组织都表达相似的基因，也就是所谓的管家基因（housekeeping genes）。

step4：矩阵减去均值

将Inf去除后，把每个样本中的基因减去该基因在所有样本中的均值。其本质上是以该基因的平均值作为参考，对每个样本中的该基因进行均一化，数学转化后即为原始reads数的相除后对数。

              sample#1       sample#2      sample#3

gene2              -1.0                0.1                0.5

gene3              -0.8                -0.3                1.3

step5：计算每个样本的中位数

这一步计算上一步每个样本所有基因对数的中位数。主要是为了排除一些极端表达基因的影响，表达量差异极大的基因会对均值造成很大影响，而对于中位数的影响则相对表达量差异小的基因小，因此，那些中等程度表达差异的基因和管家基因对中位数的影响更大一些。可能在这个举的例子里面体现不出来，因为一个sampl就2个基因，假如基因的数目很大，例如1，3，5，7，10，20，30000，这批数的中位数是7，但是均值就变成了4292.3，从中可以发现均值更容易受异常值的影响但中位数对异常值相对不那么敏感。

                sample#1       sample#2      sample#3

gene2              -1.0                0.1                0.5

gene3              -0.8                -0.3                1.3

median             -0.9                -0.1               0.9

step6：将中位数转换为真数，计算每个样本最终的标准化因子

step7：原始reads数除以标准化因子

总结：①log转换剔除值在某个样本中出现的基因

②几何平均数剔除reads中的异常值

③中位数处理进一步降低表达差异过大的基因reads数影响，从而关注中等表达差异基因（即housekeeping genes）