亲本分析（parentage）是指依据生物个体之间的遗传信息，判断个体之间亲缘关系的一种数据分析手段。用通俗的话说，就是亲子鉴定。本节主要关注亲本分析的分子标记系统，讨论亲本分析的大致流程。
一、概述
既然做亲子鉴定，显然是比对个体间的遗传数据。如果违背孟德尔定律，那么两个个体就不是亲子关系（当然，现实远没有那么简单，但我在之前的读书笔记中也提到，刚开始认识一个事物的时候，尽量保持幼稚、简单，别想着刚开始就考虑所有因素，那样只能导致被大自然这个魔术师搞得团团糟）。下游的亲本分析软件（parentage software），做的就是这样的事，即输入遗传数据，并依据孟德尔定律，给出个体间亲缘关系的推断。
但在这之前，首先我们得拿到遗传数据，而且是一个群体中每个个体的遗传数据。如果是在上个世纪前半叶，我们无从入手；但时至今日，相信有人会说，大不了每个个体测全基因组就行了（很好、很自然的想法，事实上也的确有类似于这种想法的测序技术，被称为RAD-seq）。我们把利用生物学检测方法测定（群体中）个体基因型的过程称为基因分型（genotyping），相应的生物学检测方法泛称为assay。
结果发现一个问题，即使真的有全基因组的数据量去进行亲本分析，会发现其中大量数据是冗余的，比如某个基因座（locus）在所有个体的等位基因（allele）都是A（我很非常喜欢举极端的例子，因为它们是理论发展的重要灵感来源之一）。你不会希望这样的位点放到亲本分析运算中，因为它们不会带来任何帮助。当然，一个事物没有好处和没有坏处这两者是截然不同的，应该单独讨论。事实上，类似于这样的等位基因还会带来致命的坏处，这在后续提到alleleic dropout的时候再说。因而，它们不该被放到亲本分析计算中。
这表明，在基因分型这一步骤前，还有一步至关重要，那就是分子标记鉴定（marker identificaiton）。应当筛选出基因组上中“高质量”的分子标记放到下游亲本分析中，这才是有意义的。与此同时，筛选出所谓“高质量”的分子标记，还带来了一个额外的彩蛋——复用性。也就是说，以后再做类似的亲本分析时，可以重复使用这些分子标记，就像有个分子标记数据库一样。
综上，亲本分析分三个步骤，缺一不可：分子标记鉴定 ► 基因分型 ► 下游分析。
二、用于亲本分析的分子标记系统发展
用于亲本分析的分子标记必须有两个特征：多态性（polymorphic）、遗传机制清晰。所谓多态性，就是说不同个体在该位点的等位基因不能是一样的，总要有点variation。
20世纪上半叶，亲本分析算法先于分子标记技术的发展，但如何获取遗传数据，人们还无从入手。20世纪70至80年代，等位酶（allozyme）诞生，人们开始能够获取某些位点的遗传数据，但位点数量十分有限。
等位酶是第一个检测方便的共显性孟德尔标记（Mendelian marker）。遗憾的是，它的多态性不够，因而信息量低。随后，DNA指纹（DNA fingerprinting）短暂地用于亲本分析一段时间，但Flanagan和Jones在2018年Mol Ecol.的综述说它比较粗糙，并且“relied on patterns of band sharing”，并且它不是个孟德尔标记。我没懂作者想表达什么，暂且将其搁置。
20世纪90年代，微卫星（microsatellite，SSR，或短串联重复，short tandem repeat，STR）崛起。其优点非常明显：每个基因座上有多个等位基因。但也有三个缺点：（1）有些物种的基因组根本没啥多态性的SSR位点；（2）跑胶时条带分得不太开；（3）开发成本大。
SSR的开发过程是怎样的呢？
分享一个曾经很火的方法，叫做选择杂交富集法（selective hybridization）。实验原理不详细说了（反正费时间），总之就是把基因组DNA打断，最终生成DNA文库，送测，然后根据测序结果找出序列中的重复序列，初步得到SSR。但初筛得到的SSR并不一定能用。接下来要做两轮SSR检验：（1）扩不扩得出？为每个SSR设计引物，再拿某个DNA样品做PCR扩增，并用琼脂糖凝胶电泳检验这些SSR是不是真的扩出来了。扩不出来的SSR是没有用的；（2）多不多态？在扩出来的SSR中再筛选多态性的SSR，即群体中不同样品在同一个SSR位点要出现不同的条带才行。通过两轮经验的SSR才是真正能用的。
当然，现在如果仍然采用SSR，多数情况下是从已有的基因组中直接鉴定SSR，但后续SSR检验（如检验它能不能被扩出来）的步骤还是一样的、且必需的。有人喜欢称这种开发SSR的方法叫生物信息学法，并且描述为“从NCBI等在线数据库下载序列并寻找SSR”。我不太喜欢这种说法，因为说白了，本质上就是，前人帮你测序测好了，你直接筛SSR就完了。因此，我认为没必要在概念上画蛇添足，因为这容易导致读者的困惑。不如描述成，“如今，测序数据公开在NCBI等网站上，帮我们跳过了测序的步骤，从而直接筛SSR……”
回过头来说“跑胶时条带分得不太开”这个问题。这在今天已经不是个问题了。他的意思是说，如果某个SSR位点不同等位基因的分子量差异很小，那么电泳时不同条带之间距离很近，以至于无法区分。但现在SSR可以送测，因此这不是个大问题。
用于亲本分析的分子标记有什么要求
分子标记都是服务于最终的科学问题的。在不同研究问题下，所谓分子标记“高质量”的定义方式大相径庭。就像...
什么是一个成功的人呢？
我猜你不想回答这个问题，嗯，我也一样，希望让它永远是以问题的方式存在。
用于亲本分析的“高质量”分子标记，就是要让亲本分析结果拥有高匹配度（assignment rate）和低错误率（error rate）。这两个概念在后续章节中进一步展开，我们现在仅仅简单地将它理解成核酸检测的检出率和假阳性。
尝试着考虑以下因素对亲本分析结果的影响：
– 次要等位基因频率（minor allele frequency，MAF）：某个基因座中第二常见的等位基因在种群中出现的频率。
– 哈迪–温伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）：某个基因座遗传规律满足哈迪–温伯格假设，即没有突变、选择、迁移和遗传漂变，个体间随机交配。
– 连锁不平衡（linkage disequilibrium，LD）：指不同基因座出现连锁状态。
– 缺失率（missing rate）：指某基因座获得测序数据的样品数占总样品数的比例。
– Phred质量分数（Phred quality score/ QUAL）：指某基因座存在变异的可能性。质量分数越大，样本越有可能存在变异。Phred = –10 · log(1-p)，其中p为某个样品中变异存在的概率。例如，p = 90%时，Phred质量分数为10。
– 覆盖深度（coverage depth）：指被测序的碱基占基因组大小的比率。对某个基因座而言，不同样品最终的覆盖深度不同，因而会出现最大覆盖深度、最小覆盖深度和平均覆盖深度三种指标。
– 无效等位基因（null allele/ nonamplifying allele/ alleleic dropout）：指某个杂合子在PCR扩增时，其中一个等位基因没有被扩出来，导致最终被观测成纯合子的现象。
先卖个关子。这些因素如何影响亲本分析结果，当然要等到后续展开亲本分析核心算法后才能详述。
众所周知，总体上而言，现在是SNP的时代。但目前亲本分析中SNP的使用量还不如SSR，顶多平分秋色。不少研究者是因为在他们的研究物种中找不到SSR，因此转而使用SNP，最终报道说SNP比SSR好（但我感觉说这句话真得小心）。SNP有显著的优点：（1）突变率小（尽管事实上SSR的突变率也基本不对亲本分析产生什么影响）；（2）自动化，包括测序和质量打分。
与SSR一样，鉴定SNP前也是总得先有测序数据，例如重测序（resequencing）数据，即对群体中不同个体测基因组。从测序数据中鉴定SNP有个专门的名词，叫做SNP-calling。Call出来的SNP往往还要进一步过滤，筛出更高质量的SNP，称为SNP过滤。筛选出SNP后，为每个SNP设计引物，随后就可以像SSR那样对群体进行基因分型了。
SSR分型的过程往往是“DNA提取►PCR►assay（或电泳，或送测）”。SNP分型也类似，但assay的方法更多。SNP-PCR采用和SSR相同的assay方法，走相同的流程，最终得到群体遗传学数据，其优点是价格便宜（这是最便宜的方法）。SNP芯片（SNP-chip，或SNP array）则将成十几万个SNP整合到芯片上，直接丢去高通量测序完成分型，省去了做实验，但缺点是价格很贵，并且对基因组信息依赖高，因而往往在基因组明晰的模式生物中使用较多。
可能是因为上述SNP分型的方式和SSR类似，它被称为传统SNP（traditional SNP）。提出这个概念是为了和测序分型（genotype-by-sequencing）这一概念相对。
测序分型得益于下一代测序（next-generation sequencing）技术的发展。测序分型应用于亲本分析也被认为新一代的亲本分析范式。我们说，亲本分析一般来说有三个步骤：“分子标记鉴定►基因分型►下游分析”。测序分型区别于传统分型的最显著特征——它把前两个步骤合成一个步骤了。也就是说，我测序只测一次，那就是把需要进行亲本分析的所有个体全测个遍，建个文库，然后从中Call出高质量SNP（或鉴定SSR），并直接开展亲本分析。也就是说，当分子标记鉴定出来的同时，基因分型也自然而然地完成了。
也就是回到刚开始那个看似很幼稚的想法：要搞亲子鉴定，那所有个体测个全基因组、测它个遍，难道还不解决问题吗？（请先忽略测序错误问题）
所谓下一代分子标记（next-generation marker），就是基于下一代测序思想发展的分子标记，说白了就是我懒得做实验了，通通测个序，分子标记就在那个数据集里面。
测序分型技术有：RAD-seq、多鸟枪分型（multiplexed shotgun genotyping，MSG）、外显子测序（exome sequencing）等。
测序分型也有缺点，即测序错误较多，而且测序分型的错误的检测很少被整合到下游亲本分析软件中（不像SSR测序错误）。为提高测序质量，可以进一步减少测序区间，将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针与基因组DNA杂交，进而测序。这种方式叫做目标序列捕获（target capture）。
此外，还可用转录组数据鉴定出SNP。
三、总结
本文介绍了亲本分析的大致流程，及分子标记系统的发展历程，只是为了给后续核心算法的分享做个铺垫。真正有意思的、有理论深度的，当然是分析算法。
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