陈巍学基因视频学习笔记--视频8：外显子测序

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第一部分：外显子测序技术

1. 外显子测序工作原理

针对人外显子序列设计的生物素标记的捕获探针库（可以想起PolyT探针没），这些探针和人外显子DNA序列互补。

2. DNA文库

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使用链霉亲和素磁珠将生物素标记的探针捕获，简介将被探针捕获的外显子捕获，收集磁珠后洗脱，PCR扩增之后就可以使用HiSeq测序。

3. HiSeq测序

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4. 无效数据
   （1）杂交捕获不够精确
   由于基因组中许多序列和外显子有同源性，因此要把同源序列去掉
   （2）杂交捕获的片段，只有一部分是在目标区域，另外一部分在目标区域之外，需要去除，这里有一个捕获效率的指标，安捷伦在65-70%
   （3）duplication：建库过程中，PCR扩增的时候出现重复的模板。判断依据：两个DNA分子的5'和3'的位置完全一样，则认为是同一个PCR的结果，此时留下数据质量较高的那一个，这个过程叫做去duplication。duplication的比例会随着测序量的增加而增加。
   （4）HiSeq V4 P125方法引起的：

   
   
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由于左右两个方向读下来的数据，有重叠的部分，这个重叠的部分就是冗余数据。

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除了有效数据量之外，read的均匀分布情况也会影响数据质量，当然是越均匀越好。

4. 主要应用在肿瘤外显子测序

测序深度好控制，比较容易测到low allele frequency的体细胞突变。

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外显子测序主要能够得到SNP和插入缺失突变Idel。外显子测序对基因组结构变异不敏感，是因为外显子测序只测外显子这一部分，是基因组中非常小的一部分；对小片段拷贝数变异（CNV）也不敏感，主要原因是杂交捕获过程偶然性比较大，而对大片段的拷贝数变异还是可以检测出来的。

因为外显子测序对结构变异和拷贝数变异不敏感，但又容易到达较高的测序深度，所以一般是如下使用的：

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此外，还有针对若干个基因做的捕获试剂盒，叫做Panel。例如针对实体瘤的Panel one，包含315肿瘤相关基因和28个经常发生重排的基因。因为基因捕获少，可以用比较小的数据量得到很高的测序深度，数据量小分析简单。

第二部分：外显子测序可提供的生物信息

略