病毒宏基因组学（Meta-virome）是在宏基因组学理论的基础上，结合现有的病毒分子生物学检测技术而兴起的一个新的学科分支，是某类样本中所有病毒(virus)或病毒类似物(virus-like-particle)及其所携带遗传信息的总称。国家对该方向科学研究和应用的资助也逐年增多，以下分享国家部分资助的病毒宏基因组学课题研究及其结果，希望能对该方向感兴趣的老师提供思路。
国家自然科学基金(31572529,31760736) 资助“桂越边境地区蝙蝠病毒组的研究”
本项目对四种宏病毒组测序reads进行组装，然后对其进行进化分析，结果初步揭示了这四种病毒的遗传多样性。
(1) 通过病毒宏基因组学分析获得了桂越边境地区蝙蝠携带病毒的群落结构；
①蝙蝠采集；
②样品处理：提取组织中的总核酸；再合成双链cDNA进行PCR扩增；
③高通量测序及生信分析：纯化后的PCR产物使用超声随机打断到200 bp大小, 依次通过末端修复、添加3’ dA突起、连接接头等，最后构建PCR-free文库, 文库质检合格后进行Illumina HiSeq
2500 PE125双端测序。得到的原始数据首先去除含N(≥3 bp)的reads和接头污染序列, 同时去除连续低质量序列和重复污染, 得到高质量的测序仪reads; 然后使用SOAP去除宿主基因组, 并使用脚本将reads进行拼接(限定最小重叠长度为10 bp且错配为1), 然后进行BLAS Tn和BLAS Tx注释, 参考数据库为GenBank的非冗余核酸和蛋白数据库, 限定条件为e value≤10−3.注释到病毒的序列进行SeqMan v7再拼接得到重叠序列(contigs), 其中长度超过300 bp的用于进一步分析；
④PCR检测；
⑤进化分析：测序得到的序列经过BLAST查找并下载近缘参考序列, 同时从GenBank中下载病毒的经典参考毒株和国内类似毒株序列。所有序列首先通过Clustal W 对齐后，手动裁剪到一定长度后再次对齐, 然后使用MEGA7.0软件进行系统发生分析, 进化树选择基于Maximum Composite Likelihood算法的邻接法(neighbor-joining method, NJ), Bootstrap检验设定为1000个重复。序列同源性使用DNAstar中的MegAlign软件进行计算；
⑥序列提交至GenBank。
(2) 对蝙蝠的４种病毒contig进化分析：
① 该地区可能存在２种新的小双节RNA病毒和杯状病毒；
② 多瘤病毒展示了与宿主共进化特征，肝炎病毒在蝙蝠中有着丰富的遗传多样性，可能存在一个变异株。
(3) 对蝙蝠样品６种病毒进行检测和进化分析
① 从病毒种类来看，该地区蝙蝠携带AstV具有一定的普遍性，出现在了每个检测点和多个蝙蝠品种中；
② 从蝙蝠种类来看，小黄蝠携带有AstV、CoV、RVA和RV四种检测病毒，而其它蝙蝠所携带的检测病毒都不超过２种，说明小黄蝠具有复杂的病毒本底；
③ 此次发现的肝炎病毒株与浙江和贵州的毒株存在着相互间跨区域传播；
④ 博卡病毒的进化与宿主有一定的关系；
⑤ 印证了轮状病毒能跨种传播到人或与人源的轮状病毒发生一定重排；
⑥ 星状病毒能够在不同的蝙蝠中传播、并且也能在蝙蝠和其他动物（啮齿和猪）中传播；
⑦ 弹状病毒与本课题组之前发现的毒株和目前已经报道的毒株显著的进化差异足以使其成为新的病毒属的代表成员；
⑧ 冠状病毒在蝙蝠中具有一定的物种偏向性，CoV-FCR23与新发现的猪急性腹泻病原体的HKU2或者SADS CoV具有很髙的同源性，提示防城港地区养猪业也面临着该病毒的威胁。
2. 国家自然基金项目（81573210）资助“2015-2018年广州地区急性腹泻患者粪便中病毒的检测及其分子流行病学特征”研究
(1) 研究目的
感染性腹泻（简称腹泻）是重要的公共卫生问题，病毒是引起腹泻病的主要原因，了解引起腹泻的病毒种类，认识其流行病学特征，对预防控制腹泻病有重要的科学意义。
(2) 研究方法
①研究对象、资料及标本采集
以广州某综合三甲医院为监测点，收集2015年1月至2018年1月急性腹泻患者及非腹泻对照的粪便标本，同时收集人口学和临床表现资料。
②肠道病毒检测
检测的病毒的种类包括人类轮状病毒（Human Rotavirus，HRV）、人类杯状病毒（Human Calicivirus， HuCV）、人类星状病毒（Human astrovirus，Ast）、人类博卡病毒（Human bocavirus，HBoV）、人类腺病毒（Human adenoviruses，AdV），尚存在争议的腹泻病毒包括人双埃可病毒（Human parechovirus，HPeV）、爱知病毒（Aichi virus，AiV）、Klassevirus/ Salivirus（SalV）等。
③宏病毒组学研究
用Illumina HiSeq进行高通量测序，经过质控和宿主序列过滤后，与Micro NR、Micro NT数据库进行比对，获得病毒分类注释和基因功能丰度信息。④16S rDNA高通量测序研究对粪便样本的细菌V3-V4高变区域进行扩增，构建文库，用Illumina HiSeq高通量测序，进行OTU聚类、物种分类学、多样性指数和群落结构等分析。
⑤统计学及进化分析应用SPSS 20.0进行统计分析，应用BLAST、Bioedit和MEGA5.0进行多序列比对和进化分析。
(3) 结果
①研究对象基本情况
本研究共收集5岁以下腹泻粪便标本774份，5岁以上腹泻粪便标本228份和5岁以下非腹泻粪便标本364份，患者年龄平均值分别为1.17±0.96岁、31.50±20.35岁和1.25±1.56岁。
②常见肠道病毒的检测情况
5岁以下腹泻患者各病毒检出率依次分别为HRV（14.08％）、NOV（10.98％）、HBoV（5.17％）、AdV（4.01％）、SaV（2.07％）、AstV（2.58％）、AiV（0.13％）、SalV（0.13％）；5岁以下非腹泻对照各病毒检出率依次分别为HBoV（2.75％）、NOV（2.47％）、HRV（2.20％）、AdV（1.10％）、SaV（0.82％）AstV（0.55％）；5岁以上腹泻患者各病毒检出率依次分别为HRV（5.26％）、NOV（8.33％）、HBoV（2.19％）、AdV（2.63％）、SaV（2.63％）、AstV（3.07％）、AiV（0.44％）。5岁以下腹泻患者和非腹泻对照HPeV检出率分别为10.34％和2.75％，差异有统计学意义（P＜0.001）。90例HPeV阳性株中67株为HPeV1型，8株为HPeV3型，10株为HPeV4型，1株为HPeV5型，4株为HPeV14型；5岁以上腹泻患者未检出HPeV。
③宏病毒组学
本次测序注释到47个科，119个属和309个种，儿童腹泻患者杯状病毒科（Caliciviridae）、腺病毒科（Adenoviridae）的丰度明显高于其他组，成人腹泻组微小噬菌体科（Microviridae）的丰度明显高于其他组，儿童非腹泻组肌病毒科（Myoviridae）的丰度明显高于其他组。
④16S rDNA高通量测序
本次测序注释到11个门、22个纲、37个目、63个科、198个属、393个种，儿童病毒腹泻组的微生物丰富度明显下降，厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria）为优势门，拟杆菌门／硬壁菌门比（Bacteroidetes/ Firmicutes）明显下降。
(4) 结论
①HRV和NOV仍然是致腹泻的主要病毒，但HPeV在腹泻儿童中检出率高，应值得重视，AiV和SalV与腹泻的关系有待进一步探讨。
②儿童腹泻患者的病毒构成与成人腹泻组患者、儿童非腹泻者存在差异。
③儿童病毒腹泻患者的微生物呈现失衡状态，腹泻病毒对儿童微生物群落的影响更大。
3. 国家自然科学基金（31572529, 31760736）资助“广西和新疆地区蝙蝠病毒组及小型环状DNA病毒遗传多样性研究”
（1）研究方法：
通过高通量测序，分析2016年广西11种268只蝙蝠样品宏病毒组
（2）研究结果：
① 获得了49个病毒科的reads，其中包括了脊椎动物病毒、植物病毒、昆虫病毒和噬菌体，分别占总病毒reads的83.0％、1.2％、0.4％、15.5％。
② 对小双节RNA病毒、杯状病毒、多瘤病毒和丙肝病毒等4种病毒的重叠序列进行遗传进化分析发现：
广西可能存在2种新的小双节RNA病毒和杯状病毒；
多瘤病毒展示了与宿主共进化特征，肝炎病毒在蝙蝠中有着丰富的遗传多样性，可能存在一个变异株。
③ 对蝙蝠样品中HBV、BcV、RVA、AstVcoV、RV等6种病毒进行检测和进化分析发现：广西蝙蝠携带AstV具有普遍性，出现在了每个采样点和多个蝙蝠品种中；小黄蝠具有复杂的病毒本底，携带有AstV、CoV、RVA和RV等4种病毒，而其它蝙蝠都不超过2种；肝炎病毒株与浙江和贵州的毒株存在着区域相互传播；博卡病毒的进化与宿主有一定的关系；轮状病毒能跨种传播到人，或与人源的轮状病毒发生一定重排；星状病毒能够在不同的蝙蝠中传播、并且也能在蝙蝠和其他动物（啮齿和猪）中传播；弹状病毒与本课题组之前发现的毒株和目前己经报道的毒株显著的进化差异足以使其成为新的病毒属的代表成员；冠状病毒在蝙蝠中具有一定的物种偏向性，CoV-FCRA23与新发现的猪急性腹泻病原体的HKU2或者SADS CoV具有很高的同源性，提示防城港地区养猪业也面临着该病毒的威胁。
④ 在新疆蝙蝠样品中扩增到1株双环病毒、50株圆环病毒和5株指环病毒基因组全序列，在广西地区样品中扩增到3株双环病毒、3株圆环病毒和8株指环病毒基因组全序列，并通过进化分析发现了2种新的双环病毒、3种新的圆环病毒、4种新的指环病毒。
双环病毒：在广西蹄蝠和新疆普通伏翼蝠发现该病毒拓展了其蝙蝠宿主范围；根据ICTV新种的界定，广西3株和新疆1株可能各是一种新双环病毒。
圆环病毒：在新疆获得的50株根据编码区域不同分为2种类型，且可能存在1种新的圆环病毒株，其余毒株是该毒株的变异株；在广西蝙蝠中发现3株圆环病毒，属于2种新圆环病毒。
指环病毒：在新疆获得的5株可能为1个新种，在广西获得的8株可能为4个新种。本次发现的指环病毒与己报到的指环病毒结构不同，仅仅只包括一个ORF，可能属于一种未分类的环状病毒。
（3）结论
①利用病毒宏基因组学技术分析了桂越边境地区蝙蝠携带病毒的群落结构，丰富了该地区病毒的本底数据；并分析了小双节RNA病毒、杯状病毒、多瘤病毒和肝炎病毒等10种病毒的遗传多样性及部分病毒的跨种或跨域传播的可能性。②通过PCR在新疆蝙蝠样品中扩增到1株双环病毒、50株圆环病毒和5株指环病毒基因组全序列，在广西地区样品中扩增到3株双环病毒、3株圆环病毒和8株指环病毒基因组全序列，并通过多序列比较分析发现可能存在2种新的双环病毒、3种新的圆环病毒、4种新的指环病毒。
4. 国家自然基金项目（81373051）资助“基于高通量测序的家栖鼠形动物携带细菌和病毒的流行病学调查”研究
(1) 研究背景
掌握家栖鼠形动物携带病原体的本底资料，对于鼠源性疾病的防控具有非常重要公共卫生学意义。目前鼠源性病原体调查一般是针对特定某种或几种病原体进行，难以认识鼠形动物携带病原的整体情况。本研究采用16S rDNA高通量测序和宏病毒组学的方法，探究我国部分地区家栖鼠形动物携带的细菌和病毒的群落构成、特征和差异等。同时，基于宏病毒组学研究结果，对鼠形动物样本中的丰度较高的几种重要病毒进行分子流行病学分析。
(2) 研究方法
①动物捕获和标本采集；
②16S rDNA高通量测序样本文库制备、测序和生物信息学分析；
③宏病毒组检测样本文库制备、测序和生物信息学分析；
④家栖鼠和臭鼩鼱几种病毒分子流行病学调査；
(3) 结论
①初步阐明了我国部分地区褐家鼠和臭鼩鼱的肠道菌群特征以及季节性差异：褐家鼠和臭鼩鼱肠道中均携带大量的致病菌和条件致病菌，其中臭鼩鼱所携带致病菌的丰度高于褐家鼠：不同季节的褐家鼠和臭鼩鼱均携带大量的特有细菌。
②初步建立了家栖鼠和臭鼩鼱咽部、肠道和血清病毒群落的基线数据库，并发现不同种属（褐家鼠、黄胸鼠和臭鼩鼱）、不同季节（夏秋季和冬春季）以及不同组织（咽部、肠道和血清）的病毒群落存在一定差异。
③对４种丰度较高的病毒进行分子流行病学分析：
在家栖鼠和臭鼩鼱中发现了新型的鼠细环病毒RoTTV3，其在我国三种常见的鼠科动物（褐家鼠，黄胸鼠和黄毛鼠）中均具有较高的携带率；首次在家栖鼠和臭鼩鼱中检出猪博卡病毒，且为新型的PBoV4。PBoV4广泛分布于褐家鼠，黄胸鼠和黄毛鼠中，提示鼠科动物在猪博卡病毒的储存、传播以及进化中起着重要的作用；鼠博卡病毒广泛分布在我国的鼠科动物中，具有较高的感染率，并首次在黄胸鼠中检出了RBoV，拓宽了对RBoV宿主范围的认识；首次在我国鼠形动物中开展腺相关病毒的分子流行病学调查，研宄结果显示鼠腺相关病毒在我国鼠科动物中广泛的分布，且具有较髙的感染率。
5. 国家重点研发计划(2018YFC0309800)和国家自然科学基金(91851113, 41676118)资助“深海病毒的特征及其生态学功能探讨“研究
(1) 研究背景
病毒是自然环境中丰度最高的生物类群, 对海洋生态系统中的物质能量循环和种群平衡调节发挥着不可或缺的作用. 深海是海洋生态系统的重要组成部分, 深海微生物面临多重极端环境压力. 近年来, 深海病毒相关的研究揭示了其在深海环境中的高丰度和多样性, 以及其重要的生态学功能. 本文从深海病毒的主要特征、与环境因子的相关性、深海病毒的分离与鉴定及其生理及生态功能这4个方面进行了概述, 并对未来研究的潜在方向做了展望。
(2) 研究方法和结果
通过从深海环境样品中分离及纯化病毒颗粒,进而提取病毒DNA并完成高通量测序, 通过后续的序列拼接和组装,得到完整的病毒基因组信息。
6. 国家自然科学基金资助项目( 41571248，41301265，41230857)资助“土壤病毒生态学研究方法”的研究
(1)研究概述
病毒是地球上最丰富的生物实体，每克土壤中可包含数以亿计的病毒，它不仅影响土壤中其它微生物的群落组成、土壤元素的生物地球化学循环，还会影响土壤微生物的物种进化，甚至影响植物、动物和人体健康。目前人们对土壤中病毒的种类及丰度、分布特征以及功能引起的生态环境效应还知之甚少。在概述病毒生态学研究方法的基础上，对土壤病毒的提取、纯化、定量及分子生态学方法等基本流程进行了比较分析，以期建立一套快速简便、高效稳定的适用于土壤病毒研究的方法，并用于研究土壤病毒的多样性及分布特征，探讨病毒在环境中的生存和传播机制，为土壤病毒的防控及开发利用提供支撑。
(2) 研究方法
①土壤中病毒的提取及富集；
②土壤病毒的定量；
③病毒核酸的提取；
④指纹图谱技术；
⑤宏病毒组测序；
7. 国家科学自然基金（31660714）资助“云南普洱蝙蝠病毒组学及其新病原的发现与研究”
(1) 研究背景
病毒是自然界最丰富的物种之一，很多病毒严重威胁人类健康。近年来，新发突发病毒性传染病多次发生，鉴于其高度的不可预测性、突发性、病死率高的特点，极易引起社会群体性恐慌。基于第二代高通量测序的病毒宏基因组学技术直接对环境中所有的病毒核酸序列进行检测，为调查已知和未知病毒提供了高效工具，成为发现新病毒的有效手段。蝙蝠分布范围广泛，是许多病毒的自然宿主，能携带包括多种人兽共患病毒在内的170多种病毒。蝙蝠可以通过中间宿主动物、气溶胶或抓咬伤等方式将病毒传播给人类。我国云南省西南边境与东南亚国家接壤，战略意义突出，是多种病毒性疾病的疫源地，研究发现该地区蝙蝠携带有多种人兽共患病毒。本研究旨在调查云南普洱地区蝙蝠携带病毒的多样性并发现新病毒，对防止野生动物源性病毒，特别是蝙蝠源性病毒传播给人类提供指导意义。
(2) 研究方法
在不影响蝙蝠种群延续的情况下，本研究于2016年7～9月在云南普洱各地随机收集84份外表健康的蝙蝠样品，通过PCR方法鉴定蝙蝠品种。利用本实验室建立好的高通量测序样品前处理方法对蝙蝠组织样品处理并进行Hiseq高通量测序；利用生物信息分析平台对测序后的大量数据进行针对性的病毒宏基因组学分析，获得蝙蝠携带病毒的信息。对两种具有潜在意义的新病原进行PCR验证、全基因组扩增、流行病学调查以及病毒分离等相关研究，从而获得该病毒的基因组特征、进化关系以及致病力等生物学特性。
(3) 研究结果
①84只蝙蝠包括17只中华菊头蝠和67只小蹄蝠。通过对高通量测序数据分析，共得到4,585,938条病毒序列的读长，这些病毒可以划分为38个病毒科150个病毒属。脊椎动物病毒中包含多个具有公共卫生学意义的人兽共患病毒，包括汉坦病毒、博卡病毒和弹状病毒等。
②从4只小蹄蝠体内分离到一株汉坦病毒DodeHV，获得了其S节段完整的ORF区、M节段的大部分序列和L节段的全长序列，S、M、L基因序列在GenBank中的登录号分别为MG637438、MG637437、MG637436。序列比对表明该病毒序列与越南富寿蝙蝠分离到的汉坦病毒毒株XSV最为相似，二者属同一基因型的不同毒株，但与中国已知蝙蝠汉坦病毒差异较大。
③从1只中华菊头蝠体内获得了一株弹状病毒DPRV完整的编码区序列，阳性率为在GeneBank中的登录号为MH102387。序列比对表明DPRV是一种新的弹状病毒基因型，在本研究中的阳性率为1.2%（1/48）。动物实验表明DPRV可以感染乳鼠并在乳鼠脑中复制。
(4) 研究结论
获得了我国云南普洱地区蝙蝠携带病毒的情况，进一步丰富了云南地区不同品种蝙蝠携带病毒的情况；国内首次在小蹄蝠体内发现了与越南富寿蝙蝠汉坦病毒 XSV 相同基因型的汉坦病毒毒株 DodeHV；国内首次在蝙蝠体内发现了一种新的弹状病毒基因型 DPRV，动物实验证明该病毒具有潜在的致病力。