2020-06-23 Chip-seq 数据分析（1）

1.参考文献

Brookes, E. et al. Polycomb associates genome-wide with a specific RNA polymerase II variant, and regulates metabolic genes in ESCs. Cell Stem Cell 10, 157–170 (2012).

2.文章中的原始数据：

• ACCESSION NUMBERS（文章中）
  ChIP-seq and mRNA-seq data have been submitted to the GEO repository
  under accession number GSE34520.

• GEO网站：GSE34520 显示：
  | GSE34518 | Polycomb associates genome-wide with a specific RNA polymerase II variant, and regulates metabolic genes in ES cells (ChIP-Seq) | Organism : Mus musculus | Samples (9) | Overall design：Examination of 4 different RNAPII modifications (S5p, S7p, 8WG16, S2p), and the histone modifications H2Aub1 and H3K36me3 in mouse ES cells

• SRA数据ID： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP009883 点击Accession List 下载列表并保存到文件，命名为 SRR_Acc_List.txt 使用prefetch下载。

3.数据分析简要流程图

ChIP-Seq 数据分析流程图

4.安装必备软件

（1）下载SRR数据的软件，并安装：sratoolkit.2.10.8 和 aspera

#方法1：sratoolkit.2.10.8
#下载（速度比较慢）：
>>> wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sdk/2.10.8/sratoolkit.2.10.8-centos_linux64.tar.gz
#解压：
>>> tar xzvf sratoolkit.2.10.8-centos_linux64.tar.gz
#添加环境配置：
>>> echo 'export PATH=/root/usr/local/sratoolkit.2.10.8-centos_linux64/bin:$PATH' >> ~/.bashrc（PATH="/sratoolkit的安装路径/bin"）
>>> source ~/.bashrc

#方法2：Aspera(以前可以，现在报错了，不知原因)
>>> wget http://download.asperasoft.com/download/sw/connect/3.7.4/aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz  
#解压缩 
>>> tar zxvf aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.tar.gz
# 安装（不能用root安装，要用user安装）
>>> bash aspera-connect-3.7.4.147727-linux-64.sh
# 环境配置
>>> echo 'export PATH=~/.aspera/connect/bin:$PATH' >> ~/.bashrc
>>> source ~/.bashrc  

（2）下载Miniconda3，并安装，创建chipseq镜像，并安装需要的软件

#!/bin/bash
wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
#安装 Miniconda3
bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh 
#使用conda之前需要对其做环境配置（/root/miniconda3/：miniconda3 安装路径）
export  PATH="/root/miniconda3/bin:"$PATH
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/free
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forge
conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/bioconda
conda config --set show_channel_urls yes
# 创建名字为chipseq的conda
conda  create -n chipseq  python=2 bwa
conda info --envs
source activate chipseq
# 可以用search先进行检索
conda search trim_galore
## 保证所有的软件都是安装在 wes 这个环境下面
conda install -y sra-tools  
conda install -y trim-galore  samtools
conda install -y deeptools homer  meme
conda install -y macs2 bowtie bowtie2 

5.数据分析

（1）数据下载（下载NCBI的SRA数据失败，直接下载EBI的fastq.gz）

使用aspera从EBI下载fastq数据，抛弃NCBI的SRA数据库

ENA主页：https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/home

• 1.随便搜索需要的SRR数据：SRR391032
• 2.点击:PRJNA1546325
• 3.查看fastq.gz的数据格式（可以看出该文章的数据为单端测序）

数据下载代码

#!/bin/bash
#source activate chipseq
# ways1:下载SRA数据(下载速度很慢，且下载容易中断):
cat ./SRR_Acc_List.txt | while read id
do ( nohup prefetch $id & )
done

# ways2:ascp下载raw.fastq.gz(下载SRA数据报错：ascp: Failed to open TCP connection for SSH, exiting.Session Stop  (Error: Failed to open TCP connection for SSH))
cat SRR_Acc_List.txt | while read i
do
x=$(echo $i | cut -b1-6)
echo [email protected]:/vol1/fastq/$x/$i/$i.sra
ascp -QT -l 300m -P33001  -i ~/.aspera/connect/etc/asperaweb_id_dsa.openssh [email protected]:/vol1/fastq/$x/$i/$i.fastq.gz /outdir/

（2）trim_galore:自动检测adapter的质控软件

第一步首先去除低质量碱基，然后去除3' 末端的adapter, 如果没有指定具体的adapter，程序会自动检测前1million的序列，然后对比前12-13bp的序列是否符合以下类型的adapter:

• Illumina: AGATCGGAAGAGC
• Small RNA: TGGAATTCTCGG
• Nextera: CTGTCTCTTATA

trim_galore过滤及质控代码：

# 安装
source activate chipseq
conda install trim_galore
# 过滤
analysis_dir=./Data/
ls $analysis_dir/Raw_Fastq/*gz | while read fq1;
do 
nohup trim_galore -q 25 --phred33 --length 25 -e 0.1 --stringency 4 -o $analysis_dir/Clean_Fastq/  $fq1 &
done 
# 质控Fastqc
ls ./Raw_Fastq/*gz | xargs fastqc -t 10 -o  ./Fastq_QC/
ls ./Clean_Fastq/*gz | xargs fastqc -t 10 -o  ./Fastq_QC/

（3）下载参考基因组的索引和注释文件（小鼠常用mm10）

# 索引大小为3.2GB， 不建议自己下载基因组构建，可以直接下载索引文件，代码如下：
>>> wget -4 -q ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/data/bowtie2_indexes/mm10.zip
>>> unzip mm10.zip

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