不想再用慢病毒了，我还有什么别的选择吗？piggyBac transposon

慢病毒可快速、高效的将目的基因整合到宿主细胞基因组，非常适合用于构建稳转细胞株。但慢病毒也有缺点，即使是稳转细胞株，可能会随着传代次数的增加而慢慢丢失干扰或者过表达的效率。其中可能是原因是在多克隆稳转细胞系的培养过程中，经慢病毒整合的细胞可能相对于野生型在生长活力没有优势，因此随着传代次数的增加，经整合的阳性细胞数目慢慢变少，从而导致效率降低。在这种情况下可以选择挑选单克隆稳转株的方式。

1. 转座子

在几乎所有的基因组中，基因组变异的一个主要原因是转座因子（transposable element，TE）或称为转座子（transposon）。转座子是基因组中可以自由移动的分散的DNA序列，它们可以将自身从基因组的一个位置直接转移到另外一个位置而不依赖于噬菌体或者质粒DNA等原件的帮助。依据转座子的转座机制，可分为以下两种：

（1）逆转座子（retrotransposon)：首先需要认识到，转座子是存在于基因组DNA中的，它并不是外来物。因此基因组中的一类转座子可以首先从基因组中转录出RNA，该RNA有类似逆转录病毒的作用，该RNA通过逆转录的方法生成DNA，并整合到基因组中的新位点，这种方式类似于“复制--粘贴”。逆转座子有LTR和non-LTR两种。

（2）DNA转座子（DNA transposons）：顾名思义，是直接可以转座的DNA片段，该片段由转座酶催化而转移，这意味着该转座子应包含转座酶识别的位点，另外转座的位点可以是随机的，也可以是有特定位点的，这依赖于转座酶是否有特异性识别的靶基因序列，如果有则将转座子片段特异的转座到该位点，这就造成了跳跃的现象，因此转座子也叫做跳跃基因。睡美人转座子（sleeping beauty transposon）就是一类DNA转座子。这种方式类似于“剪切--粘贴”。

而依据转座的启动方式，则又分为自主转座子和非自主转座子
（1）自主转座子：自主即是不要依赖于其他因素的帮助，可自发转座的转座事件。
（2）非自主转座子：需要转座酶、逆转录酶等其他因素帮助的转座事件。

转座子

2. 转座子结构

按照Class I和Class II的分类来看：
（1）作为逆转座子系统的Class I，由于是“复制--粘贴”的模式，因此逆转座子的结构中一般包含RNA结合蛋白、逆转录酶等编码序列，从而达到“自给自足，逆风翻盘”的效果。
（2）作为Class II的DNA转座子，由于是“剪切--粘贴”的模式，那么剪切需要转座酶来实现，因此在DNA转座子的两端，会有可供转座酶识别和作用的位点，同时有一些DNA转座子还带有一些特殊的序列用以识别特定的基因组位点，从而定向转座。

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3. 慢病毒与转座子系统的对比

转座子的优点：操作简单，可承载的基因片段大，无需包装慢病毒，“后悔”插入还可以删除，全身而退，一般用于删除抗性基因/荧光标签，避免和后续慢病毒等基因编辑工具在筛选标记上有冲突。
转座子的缺点：转染效率低会影响整合效率，质粒设计比较复杂（大约是因为我不会），异染色质化会沉默基因表达，此时需要加入绝缘子。

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4. 转座子系统学习案例：piggyBac插入iCRISPR-Cas9系统

从上面第2点转座子结构中我们可以看到，DNA转座子系统的成员是最多的，包括大名鼎鼎的睡美人转座子（sleeping beauty transposon，SB）：

关于SB转座子的发现，这中间还有一个美丽的故事。科学家们犹如王子，唤醒了鲑鱼中已经失活了千万年的转座子系统，而在这个过程中，生物信息学分析方法起到了关键的作用。在1997年，Ivics等人通过生物信息学分析方法，找到了鲑鱼转座子的保守序列，从而确定了已经灭绝的鲑鱼中具有活性的睡美人转座酶的基因序列，随后对这个古老的转座子进行了分子水平的重建，最终成功唤醒了沉睡千万年的转座子活性，因而得名睡美人。

而今天我们要讲的是一个新的人工修饰的转座子系统：piggyBac
piggyBac转座子最初于1983年在飞蛾体内发现，但直到2005年才成功用于哺乳动物细胞的基因编辑，它的特点有如下：
（1）作为经修饰后的DNA转座子，piggyBac有两个组成部分，转座子和转座酶；（2）piggyBac转座酶促进转座子的基因组整合，尤其喜好基因组的TTAA位点；
（3）转座酶也能以完全无缝的方式切除转座子，不留下任何序列或突变；
（4）piggyBac具有较大的载货能力(已证明超过200 kb)，并且没有已知的上限。

piggyBac质粒学习
这是我从Addgene上找到的一张piggBac的质粒图谱：

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（1）红色箭头所指向的两个橙色小元件是piggyBac的末端重复序列（IR），这个序列可被转座酶识别并且切割，同样这个序列会倾向于转座至基因组的TTAA位点；
（2）可以看到左右两个IR之间有新霉素和卡那霉素抗性基因（NeoR/KanR），可用于作为筛选标记。随后CMV、T7启动子后面接着的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）也可以作为筛选标记；
（3）除第（2）描述的元件外，我们不难看到在NeoR/KanR两侧有loxP标记，因此在转座子整合成功后，还可以使用Cre将抗生素筛选标记切除，以免与后续基因编辑冲突。需要注意的是使用Cre后，基因组中会留下一个loxP位点，这将改变内源性DNA序列，从而导致细胞毒性；
（4）需要注意piggyBac被整合到基因组之后，该转座子的IR序列还能被转座酶识别，从而完全无缝的切除piggyBac转座子。

下图则展示了piggyBac从插入到被删除的过程

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5. piggyBac系统的注意事项

下面根据所查到的资料以及个人使用经验，罗列自己能想到的使用注意事项：
（1）piggyBac的投递方式是质粒转染，因此细胞的被转染效率非常重要；
（2）使用piggyBac时，基因被完整地插入基因组，而使用标准的DNA质粒转染时，被插入基因可能出现双链断裂；
（3）可以通过提高转座酶与转座子的比率提高转座子的整合率；
（4）应用piggyBac构建过表达细胞系的时候需要注意基因过表达不是越高越好，过高的蛋白表达可能导致细胞死亡，因此转座酶与转座子的比率还需要使用者根据实际情况决定；
（5）piggyBac倾向于整合到染色质开发区域，例如启动子和外显子区域，如果细胞的染色质结构经历了重大的重排（如当干细胞开始分化），任何整合的转基因一样，可能会发生转基因沉默。因此建议在分化过程中保留筛选标记，同时还可以使用PCR跟踪整合效率；
（6）piggyBac可以和其他基因编辑手段结合，如CRISPR/Cas9、TALENs和ZFNs等，使得基因编辑更加灵活。例如和CRISPR/Cas9结合时，piggyBac可作为一个HDR模板被整合到基因组中，而后期还可使用转座酶移除；
（7）piggyBac加载的片段太大时，有可能使ITR的核酸酶位点被破坏，从而防止再次切割。

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最近在师兄DZ的指导下，将iCRSPR作为转座子插入序列，例用piggyBac系统整合到基因组中，成功得到了inducible的CRISPR系统，这让我一扫之前做IKO系统失败的阴霾。piggyBac系统的使用，拓宽了我对基因编辑技术的认知，我仿佛像一个饥肠辘辘的人，发现一扇大门的门缝，惊觉这门外有很多已经创造了数年且我从没见过的食物。这技术爆炸的时代，我们不断的感叹自己的何其有幸，又不断懊恼时间的如此有限。个人的力量极其微弱，谨以此小小一文，希望能收获大家的经验之谈，我总是从你们身上学到许多，感谢。