项目文章丨单细胞转录组测序助力先天性小耳畸形发病机制研究

2022年2月，来自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院的张天宇和马竞团队在Clinical and Translational Medicine杂志上合作发表了题名为“Single-cell transcriptomics reveals pathogenic dysregulation of previously unrecognised chondral stem/progenitor cells in children with microtia”的论文，该研究通过单细胞转录组测序技术，系统地注释了人类耳廓软骨中的软骨相关细胞亚型，首次鉴定了软骨层中存在未报道的成体软骨干/祖细胞（CSPCs）以及其调控紊乱在先天性小耳畸形发生中的关键作用。该研究中的单细胞转录组测序服务由博奥晶典提供。

【发表期刊】Clinical and Translational Medicine

【发布时间】2022年2月

【影响因子】11.492

【检测技术】单细胞转录组测序、免疫荧光、免疫组化

研究背景

先天性小耳畸形是颅面部第二大出生缺陷，由外中耳的发育不良引起，对儿童的生理和心理发育都有不良影响。然而，目前的治疗方式一直存在局限性，病因和发病机制也尚不明确。

研究路线

研究结果

1.人耳廓软骨的 scRNA-seq

该研究对3例小耳畸形儿童和6例正常对照（2名儿童和4名成人）的耳廓软骨进行了单细胞转录组测序分析，共获得47214个细胞的转录组信息，鉴定为7种细胞类型，其中有4种软骨相关的细胞类型，包括软骨干/祖细胞（CSPCs）、软骨细胞（Chonds）、基质干细胞/祖细胞（SSPCs）以及基质细胞（SCs）。通过拟时间轨迹分析发现，CSPCs 分化为 Chonds（软骨谱系）而 SSPCs 分化为 SCs（基质谱系）。作者结合免疫荧光实验发现，SSPCs 特异性地位于过渡层和内软骨膜，CSPCs 特异性地位于软骨层和过渡层，该发现与先前已发表的软骨膜干细胞的描述不同。

图1 通过人耳廓软骨 scRNA-seq 分析确定的7种具有转录特征的细胞类型

2.软骨谱系和基质谱系的亚组分析

该研究分别对软骨谱系和基质谱系进行了亚组分析。作者发现软骨谱系中有4种亚型，CSPCs 先进展到早期软骨细胞（ECs），再从中间软骨细胞（ICs）到晚期软骨细胞（LCs）。CSPCs 中高表达干细胞标记物、软骨细胞分化和细胞外基质（ECM）的相关基因，但这些基因的表达从 ECs 到 LCs 逐渐下调，而软骨退化相关基因从 CSPCs 到 LCs 逐渐上调。作者在基质谱系中发现了3种亚型，通过 GO 功能富集分析发现，SC1 可能主要负责与软骨组织外其他类型细胞的通讯，而 SC2 可能辅助软骨形成。接下来，作者通过 SCENIC 方法构建基因调控网络，确定了4个主要的调控子，包括 CSPCs 的 SOX8 调控子、 ECs 的 NFATC2 调控子、ICs 和 LCs 的 SOX9 调控子以及基质谱系的 FOXP1 调控子。

图2 基于发育轨迹的软骨和基质谱系的亚型

3.年龄对软骨谱系影响的综合分析

为了研究年龄对软骨谱系的影响，作者对正常对照组中不同年龄的软骨谱系进行了比较，发现儿童中 CSPCs 和 ECs 的比例较高，而 ICs 和 LCs 的比例较低。成人的软骨谱系中上调和下调的 DEGs 分别与衰老和 ECM 的形成相关。此外，作者发现所有亚型细胞的 DEGs 显著富集于 Aging Atlas 和 GenAge 数据库中。在成人软骨谱系的所有亚型中，作者发现了转录因子 CEBPB 与和其互作分子 CEBPD 的表达及调控活性的上调。通过基因调控网络（GRN）分析证实，CEBPB 和 CEBPD 靶向上调的 DEGs 与衰老相关。

图3 年龄对软骨谱系影响的综合分析

4.先天性小耳畸形软骨谱系细胞亚型特异性基因表达谱

接下来，作者探索了软骨谱系的异常在先天性小耳畸形发生中的作用，发现与其它细胞亚型相比，小耳畸形儿童中 CSPCs 的比例显著降低低；CSPCs 的功能异常程度最大；转录因子的失调只出现在 CSPCs 中。这些提示 CSPCs 可能是小耳畸形发病的关键环节。为了确定 CSPCs 中哪些转录因子的失调可能是疾病的潜在致病机制，作者通过 PageRank 算法发现在下调的转录因子中，SOX8 得分最高，表达下降幅度最大，其靶基因和 ECM 组成和软骨发育过程相关。而在上调的转录因子中，EGR1 显示出高的差异表达和 PageRank 评分，其靶基因主要参与氧化应激发应。最后，作者通过免疫组化实验证实，小耳畸形 CSPCs 中 SOX8 蛋白表达下降，EGR1 蛋白表达增加。

图4 小耳畸形细胞亚型特异性基因表达谱

研究结论

本研究通过单细胞转录组测序系统地注释了人类耳廓软骨中的软骨相关细胞亚型。本研究还首次描述了软骨层中的 CSPCs，可能具有定向软骨细胞分化的潜力，并发现了 CSPCs 中转录因子 SOX8 和 EGR1 的失调可能通过影响软骨发育和氧化应激反应从而导致先天性小耳畸形的发生。这一发现为进一步探索小耳畸形的发病机制奠定了理论基础，并为潜在的治疗提供了新的途径。

参考文献：

Ma J, Zhang Y, Yan Z, et al. Single-cell transcriptomics reveals pathogenic dysregulation of previously unrecognised chondral stem/progenitor cells in children with microtia. Clin Transl Med 2022;12(2): e702.