单细胞转录组测序知识一隅

作者：Raymon T
编辑：angelica

01 什么是单细胞转录组测序？

单细胞转录组测序（Single Cell RNA Sequencing）是在单细胞水平对mRNA进行全转录组扩增及高通量测序的一种高端技术，研究单个细胞内的整体基因表达情况，以及基因的结构变异。主要用于细胞分子机制中细胞异质性研究、以及样本量少而无法进行常规高通量测序等。单细胞RNA-Seq提供成千上万个单个细胞的转录谱，这种水平的通量分析使研究人员能够在单细胞水平上了解哪些基因表达，多少数量以及异质样品中成千上万个细胞之间的差异。
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5.单细胞RNA系列专题之一：单细胞RNA测序中质控之重要细节 （下篇）

02 10X单细胞RNA-seq测序工作流程是什么？

10xGenomics单细胞转录平台作为近来最常见的一种单细胞产品，其工作流程概述如下：

1. 将样品组织/细胞分散成单细胞悬液；

2. 在微流控系统中与sequencing beads形成GEMs；

3. 在GEMs中细胞被裂解--建库；

4. 进行文库测序；

5. 下载数据进行分析（cellranger）

03 什么是GEMs？

GEMs（Gel Bead in emulsion），每一个GEMs均是Gel Bead + Master Mix + Cell Lysate的混合，其中Master Mix是即用型的常规PCR预混合溶液；Cell Lysate表示细胞裂解液。如下图所示：

04 10X单细胞主要实验步骤是什么？

具体的实验流程如图所示，最终含有细胞的油滴占所有油滴比例大约5%，更好地保证了含有细胞的油滴里面只有1个细胞，一个包含细胞的油滴内就是一个单细胞scRNA-Seq。每个GEMs内包含独特的10X barcode用于区分不同的单细胞；每个GEMs内相同的10X barcode与不同的UMI组成用于区分不同转录本的Gel Bead poly(dT) Primers。

05 10X单细胞建库中试剂V2和V3的区别是什么？

V2和V3版本的实验过程和基本原理相同，用于生成3'基因表达文库的Gel Bead poly(dT) Primers差异主要是UMI随机序列长度从10bp增加到了12bp。UMI多样性增加，相应的Gel Beads上Primers的数量也从73多万种增加到350多万种，在相同测序深度下V3能发现更多的基因；GEMs（油包水）数量未有改变，还是能鉴定500-10,000个细胞。下图可见V2和V3结构区别：

06 V2和V3最终的文库结构是什么样的？

下图显示了具体的R1,R2和I1三种数据文件的主要内容，其中V3试剂的R1比V2试剂的R1要长2bp，详情见下方：

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