bam&sam文件浅析

1. sam 和 bam 背景知识

现在最流行的短序列比对软件就是bwa 和 bowite2，而sam文件就是通过这些比对软件进行序列比对后 产生的文件的格式。sam (sequence alignment/map)格式是一种通用的比对格式，用来存储reads到参考序列的比对信息。sam是一种序列比对格式标准，由sanger制定，是以tab为分隔符的文件格式。主要应用于测序序列mapping到基因组上的结果表示。
其实，bam文件和sam文件内容是一样的，只是bam是二进制的压缩文件，需要通过特定的软件来进行查看。所以，接下来的描述就只称呼sam啦～

2.sam的内容格式

sam分为两部分，header section (注释信息) 和 alignment section （比对结果）。

2.1 header section 注释信息

其实，在bam 或 sam 文件中，header section 都是可有可无的，它们以@开头，记录一些文件信息

• @HD 说明符合标准的版本、对比序列的排列序列
• @SQ 参考序列说明
• @RG 比对上的序列（read）说明
• @PG 使用的程序说明
• @CO 任意的说明信信息

2.2 alignment section 比对结果

alignment section 才是bam or sam 文件重要的部分，其中每一行都表示一个片段（segment）的比对信息，包括11个必须的字段（mandatory fields）和一个可选字段，字段之间用tab键分隔。其中，必须的11个字段顺序是固定的，不可用时，根据字段定义，可以为0或*。
了解数据就是要看得懂alignment section中每一行比对结果表达的含义，所以，要知道11个必须字段和其中1个可选字段所表达的是什么。

看一下sam的11+1个字段都包含了什么（下面的解释内容以此为例）：

图1 sam文件alignment section中的一行

（1）QNANAME

比对片段的template的编号；read name （通常包括测序平台等信息）
eg: A00602:165:HTHKCDSXX:1:1101:7039:1000

（2）FLAG

位标识，template mapping情况的数字显示，每一个数字代表一种比对情况，这里的值是符合情况的数字相加获得的总和。

flag取值

1（1）该read是成对的paired reads中的一个
2（10）paired reads中每个都正确比对到参考序列上
4（100）该read没比对到参考序列上
8（1000）与该read成对的matepair read没有比对到参考序列上
16（10000）该read其反向互补序列能够比对到参考序列
32（100000）与该read成对的matepair read其反向互补序列能够比对到参考序列
64（1000000）在paired reads中，该read是与参考序列比对的第一条
128（10000000）在paired reads中，该read是与参考序列比对的第二条
256（100000000）该read是次优的比对结果
512（1000000000）该read没有通过质量控制
1024（10000000000）由于PCR或测序错误产生的重复reads
2048（100000000000）补充匹配的read

eg：图1的 flag 99=1+2+32+64 对应提供的信息即为：
1:该read是成对的paired reads中的一个
2:paired reads中每个都正确比对到参考序列上
32:与该read成对的matepair read其反向互补序列能够比对到参考序列
64:在paired reads中，该read是与参考序列比对的第一条
因此可以看出这条read与参考基因组非常匹配

（3）RNAME

参考序列的编号(就是指 染色体位置)，如果注释中对SQ-SN进行了定义，这里必须和其保持一致，另外对于没有mapping上的序列，这里是”*”
eg: chr=1

（4）POS

比对上的位置，如果没有比对上，此处为0
eg:POS=64655942

（5） MAPQ

mapping的质量，比对的质量分数，越高说明该read比对到参考基因组上的位置越唯一
eg: MAPQ=60

为什么要有mapping质量这个指标呢？
因为bowtie2 有时并不能完全确定一个短序列来自参考序列的哪个位置，特别是对那些比较简单的序列，但是bowite2会给出一个值来显示这个段序列来自某个位点的概率值，这个值就是mapping qulity。计算方法：Q=-10log10P(P是这个序列不来自这个位点的估计值)。一般结果是0-60，而且0和60这两个数字出现次数最多。数值越大说明越可靠

（6）CIGAR

简要比对信息表达式（Compact Idiosyncratic Gapped Alignment Report），以参考序列为基础，使用数字加字母表示比对结果，match/mismatch、insertion、deletion对应字母 M、I、D。比如3S6M1D1I4M（这是按照顺序来的：前3个碱基被剪切去除了，然后6个比对上了，然后又缺失了一个碱基，然后又有一个碱基插入，最后4个碱基完全匹配。）

理解CIGAR

这里插播一下clip的概念
Softclip 是指一条序列上，两端有比对不上的序列部分，虽然比对不到基因组，但是还是存在于SEQ(segment SEQuence)中的序列，在CIGAR列中对应S（Soft）的符号。直白点说，就是虽然比对不上参考基因组，但是在BAM/SAM文件中的reads上还是存在的序列（并没有被扔掉）
Hardclip 表示比对不上并且不会存在于SAM/BAM文件中的序列（被截断扔掉了的序列，此时CIGAR会留下H Hard的符号，但是序列的那一列却没有对应的序列了）
通常来说，Hardclip 是依赖于Softclip 存在的，因为Hardclip 存在的本意是降低BAM文件中序列的冗余度。例如，一条150bp的序列在其70bp处存在剪切，它能比对到参考基因组的A（70M80S）、B(70H80M)两个地方，由于这条read已经在A位置储存了完整的序列信息，因此可以在B位置引入Hardclip的标记（标记为secondary）。
eg: 150M 150个碱基完全匹配

（7）RNEXT

下一个片段（相对于read 1，指对应的read2）比对上的参考序列的编号，如果read1 和 read 2对应同一个片段，用“=”表示（没有另外的片段-例如SE测序得到的read，这里是“*”）

（8）PNEXT

下一个片段（相对于read 1，指对应的read2）比对到参考序列上的第一个碱基位置，若无mate（如 单端测序）即为0
eg: Pos=64656194

（9）TLEN

估计出来的片段长度，当mate序列位于本序列上游时该值为负值
由上面可以看出（7）、（8）、（9）是mate的信息，如果是单端测序的数据，这三列都是无意义的
eg: TLEN=402

（10）SEQ

这里储存的是 序列片段的序列信息，值得注意的是CIGAR中的M/I/S=/X对应数字的和要等于序列长度
eg: NGGTGCTACTGCTGCCTGGACTTCTGTTGCAGTCCAACCTAGTACTGACACCGTATGGTTTGAAACCAGGTATGGACAAAGTAGCCAATGGGCTGAACTTAGAGTAGTATGGATGGTGATCACCAAGGAGGTGACACCTATAGTTATCTG

（11）QUAL

序列的质量信息，read质量的ASCII编码，格式同FASTQ一样
eg:
#FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFFF:FFFFFFFFFFF

（12）可选的字段（field）

AS:i 匹配的得分
XS:i 第二好的匹配的得分
YS:i mate序列匹配的得分
XN:i 在参考序列上模糊碱基的个数
XM:i 错配的个数
XO:i gap open 的个数
XG:i gap延伸的个数
NM:i 经过编辑的序列
YF:i 说明为什么这个序列被过滤的字符串
YT:Z
MD:Z 代表序列和参考序列错配的字符串
eg: NM:i:1 MD:Z:0A149 MC:Z:150M AS:i:149 XS:i:92 RG:Z:NULL