体外筛选新技术助力新冠病毒单克隆抗体 |药物筛选|体外筛选|爱思益普

高亲和力抗体的研发对于新冠病毒诊断和治疗具有重要意义。目前的两条主要研究策略，一是挖掘已开发的具有交叉保护活性的SARS病毒抗体，这种方法快速但与新冠病毒的亲和力较低。另一种方式是从感染患者中分离单克隆抗体，但是难以大规模分离制备。近日，日本名古屋大学的研究者开发了转录翻译偶联嘌呤霉素接头展示(TRAP)的新技术，在短时间内就可筛选出靶向新冠病毒刺突蛋白的单克隆抗体，并且对病毒中和效力显著，为快速开发新发传染病抗体提供了新的途径，研究结果发表在国际知名期刊 Science Advances上。

体外筛选技术是一类重要的抗体类似蛋白生产技术，这种技术避开了繁琐的动物免疫，而利用免疫蛋白支架如单链可变区、单域抗体、非免疫球蛋白，快速筛选抗体库。经典的方法包括噬菌体展示技术、mRNA展示技术等，然而噬菌体肽库太小，而mRNA肽库构建又耗时过长。研究者在前期研究开发了一种高通量筛选体外功能肽段的方法，即TRAP技术：DNA模板加入体系后，在T7聚合酶催化下转录为mRNA，迅速结合嘌呤霉素-DNA接头，由核糖体进行翻译，嘌呤霉素再连接到多肽链上，逆转录、免疫沉淀后筛选功能多肽，再通过PCR扩增进行下一轮筛选。

TRAP体外筛选

研究者发现，单抗体的DNA 3'模板会不依赖启动子转录形成杂交链阻碍后续反应，因此需要通过引入甲氧基修饰阻碍无效转录，实验结果明显提高了展示效率。同时研究者也注意到首轮筛选时存在抗体库种类有限的问题，于是通过外源添加mRNA库，提高了抗体多样性。EGFR1、HER2的抗体筛选证实了该方法的有效性。

为了构建新冠病毒抗体库，研究者首先在单抗体BC、FG环上引入随机突变，并采用含多种密码子的混合液进行随机库构建。同时预先构建了大规模的mRNA库，在后续多轮筛选中可以扩充多样性靶向多种位点。研究者针对SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基和受体结合结构域进行TRAP筛选，第一轮采用mRNA库作为模板，后续逐步筛选高亲和力抗体，经过6轮筛选在3-4天内就获得了单抗株。研究者选取了其中丰度最高的9株抗体，进行生物活性的测定。酶联免疫吸附实验(ELISA)显示不同抗体均可以与S1亚基RBD结构域结合，在37℃均保持稳定，部分抗体在50℃依然保持活性。生物膜层光干涉实验进一步测定了抗体结合动力学参数，7株抗体表现出亚纳摩尔至纳摩尔级别的亲和力。

酶联免疫吸附和亲和力常数测定

抗体阻断ACE2-S1结合

夹心ELISA检测

研究者进一步分析了抗体对完整病毒颗粒的结合能力，免疫磁珠结合RT-PCR显示了抗体有效结合并沉淀了病毒粒子。利用这种抗体免疫磁珠偶联RT-qPCR的方法最低可以在1uL液体中检出0-1个病毒粒子。为了说明该方法可以应用于临床快速检测，研究者又对COVID-19患者鼻拭子进行了“pull down”偶联RT-qPCR的方法，检出率明显高于传统qPCR，但是由于患者体内存在中和抗体，有一定程度干扰。

pull down qPCR与传统qPCR比较

为了进一步提高抗体的结合能力，研究者试图将抗体形成并列二聚体的结构，选取其中三株构建二聚体，亲和力明显提高，达到亚皮摩尔级别。这主要是二联抗体能够通过桥联作用与抗原形成网络状结构所致。

二聚体亲和力

6号单克隆抗体及其二聚体具有最高的亲和力，研究者推测该抗体可能有效阻断病毒感染。在表达TMPRSS2的VeroE6细胞单抗体能够有效抑制新冠病毒，IC50达到亚纳摩尔。