拜谱生物|解读
研究对象：肝脏肥大细胞(CCH)的肝切除（Phx）
标题：肝再生过程细胞代谢路径的重构
期刊：Developmental Cell（IF=9.616）
发表时间：2018.10.18
关键词：肝脏再生，转录组学，代谢组学，高级分子影像学，线粒体氧化线
肝脏疾病与肝细胞分裂能力下降密切相关，并且细胞代谢对组织稳态和再生很重要。由于代谢变化是肝脏疾病的标志，因而对代谢和细胞分裂之间的联系进行了研究。运用转录组学、代谢组学分析以及功能性氧化还原体内成像技术，确定了肝脏再生过程不同阶段的全局性代谢变化。结果表明，再生期间阻断肝细胞分裂导致线粒体功能障碍和氧化途径的下调。这导致氧化还原比率增加和线粒体功能受损，并引起丙氨酸转氨酶的活性增强，使得丙酮酸产生丙氨酸和α-酮戊二酸的流量增加。总的说来，肝再生过程中，细胞分裂导致肝脏代谢重塑。此外，肝细胞具有灵活的代谢机制，能够动态适应组织再生过程中的变化。
研究内容及结果
细胞和有机体肝脏再生过程的生理变化
该研究使用切除2/3肝脏质量的小鼠模型(PHx)，使用鬼笔环肽和DAPI对冷冻切片进行染色来呈现再生过程不同阶段（图1A）中肝细胞大小的变化（图1B）。
图1 野生型小鼠肝脏再生的生理学变化
肝脏切除后细胞尺寸的变化如图1C，在36 h达到峰值，然后又慢慢降低。图1D中36 h的细胞存在两个肝细胞群，而其他时间点仅有一个细胞群，这表明在36 h肝细胞群可能存在异质性。在研究细胞周期时（图1E），确定了两个重要基因的表达––––细胞周期蛋白依赖性激酶1(Cdk1)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(p21CIP1/WAF1）。Cdk1是细胞分裂的必需激酶，其缺失肝细胞将不会分裂。如图所示，Cdk1的RNA水平36 h达到峰值并在168 h回到基线，表明这段时间的细胞分裂很重要。相反，p21CIP1/WAF1的RNA水平在8 h相较于0 h增加，在36 h（DNA复制期）一直保持很低的水平（图1F）。
另外,该研究测量了肝损伤和代谢的两个替代指标––––血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和葡萄糖的水平。8h的ALT比0 h增加24倍，随后逐渐恢复到初始水平（图1G）。在肝再生的起始阶段(8 h)总葡萄糖大概降低到初始阶段的一半，然后在168 h时恢复到0 h的水平。这些结果均表明肝脏再生伴随着转氨酶和葡萄糖代谢的变化。
转录组学结合体内分子成像技术揭示肝再生过程中生物氧化的变化
该研究使用RNA-seq确定mRNA的表达量，以此来探究与肝再生相关的代谢途径。统计学分析表明显著变化有60个途径，其中24个含有最具代表性的基因组（图2A）。
图2 肝再生过程中的肝细胞分裂伴随着NADH和FAD的增加
由于通过基因表达数据确定氧化代谢的变化存在一定的局限，本研究使用活体成像技术来分析小鼠的代谢。如图2B所示，NADH在肝再生期间持续的增加，表明NADH在肝脏分裂和组织恢复中起作用。总FAD显示出类似的趋势(图2C和图2F)。此外，通过生物化学法测定脱朊样品中总NADH(图2G)和NADPH(图2H)，结果表明NADH在肝再生过程中表现出持续的增加，而NADPH在8 h时达到峰值，随后降低。这些结果表明活体成像能够用于肝再生期间氧化还原力的测量，并且在野生型动物的肝再生过程中NADH起主导作用。
此外，该研究测量了NAD+依赖型的谷氨酰胺合酶（Nadsyn1）和烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt）的基因表达(图2I和图2J)，它们分别参与NAD+的从头合成和补救途径。96 h这两种酶的mRNA表达量均达到最高。图2K中，0 h 到8 h谷胱甘肽过氧化物酶(Gpx3) 的表达量增多，这与NADPH的变化趋势一样，而过氧化氢酶(Cat) (图2L)和超氧化物歧化酶(Sod1) (图2M)的mRNA水平大体上是减少的。总之，这些结果表明生物氧化过程在肝再生过程中发挥不同的作用：肝脏再生的初始阶段需要氧化压力，之后对于NADH的需求增加，后期组织损伤得以消退。
抑制肝细胞分裂导致氧化代谢减少和氧化还原比增加
肝切除之前，与WT相比, 肝细胞代偿性肥大(CCH)的小鼠的ALT活性约是WT的2倍，8 h后活性最高，然后在96 h恢复到初始水平(图3A和1G)。然而，在每个时间点，CCH中ALT活性均高于WT，表明CCH的肝损伤比WT小鼠更严重。相较于WT小鼠，CCH小鼠的血糖水平明显减少，并且一直保持在较低的水平直到168 h才恢复到正常水平(图3B和1H)。此外，图像分析表明，36 h的CCH细胞大小是WT的3倍(图3C,3E)。代谢通路分析结果表明下调途径大多为代谢反应，氧化途径的下调更加显著，并且这一现象在CCH中比WT中更加明显（图3D）。
图3 肝细胞补偿性肥大的小鼠肝再生过程中氧化作用减少
通过CCH与WT的转录组学分析，揭示CCH小鼠生理学变化的根本原因。研究发现848(6.3%)个基因的表达变化倍数大于2，2305个基因(17%)的变化倍数大于1.5。
为了进一步验证氧化代谢的减少，然后该研究使用活体成像技术来对CCH和WT中NADH和FAD进行定量（图3E-3H）。FAD在再生过程中略微增加，但NADH在8 h和36 h明显下降（图3I），然后在96 h恢复到初始水平（图3J）。在WT肝脏再生期间，氧化还原比接近1，这表明细胞处于氧化还原稳态。但是，CCH肝脏中的氧化还原比较高。为研究氧化反应的来源，对NAD+/NADH和NADP+/NADPH进行了测定(图3N和3O)。有趣的是，与0 h相比，再生期间WT小鼠的NAD+/NADH降低，表明线粒体代谢为肝脏再生提供了支持。NADP+/NADPH的比例在8 h和36 h降低，但在96 h增加约3倍。在CCH肝脏中，NAD+/NADH显著升高，表明减少的氧化代谢可能与线粒体代谢的受损有关。
CCH组织再生导致线粒体功能降低
线粒体氧化代谢是肝再生过程所需代谢物和能量的最有效的产生方式。由于线粒体电子传递链（ETC）是NADH和FAD的主要来源之一，因而CCH组织再生受损，并且肝脏的再生速度将慢于WT。但事实上，肝脏再生的速率并未受到严重损害。所以，尽管氧化途径显著减少，CCH的肝再生也能够完成。为了验证这一结论，对CCH再生过程线粒体中的代谢进行了研究。首先分析了OXPHOS蛋白的表达（图4A），在WT（图4B）和CCH（图4C）中复合物II，琥珀酸脱氢酶B（SDHB）的变化较明显。此外，WT中SDHB蛋白浓度与肝脏中的NADH荧光成正相关(图4D)。SDHB是唯一参与TCA和OXPHOS代谢的酶，因此它是线粒体代谢反应的中心酶。
图4 CCH组织再生与线粒体代谢受损的相关性
然后，该研究使用Seahorse分析原代肝细胞的线粒体呼吸参数。结果表明WT动物的肝细胞（iWT），在肝切除后36 h耗氧率（OCR）显着增加（图4E），其与线粒体呼吸参数的增加相关（图4F）。CCH的肝细胞（iCCH）在肝切除后36 h后无明显增加（图4G），线粒体呼吸参数基本不变（图4H）。这表明WT肝细胞从静止状态（肝切除前）到增殖状态（DNA复制期）伴随着OCR的增加。相反，CCH肝细胞由于Cdk1的缺失而不增殖，因此它们需要替代的代谢变化。将iWT和iCCH肝切除前后的OCR值进行比较时，结果显示iCCH肝细胞的呼吸储备能力显著降低，表明iCCH肝细胞的能量应激能力受损（图4I）。此外，iCCH肝细胞在肝切除36 h基础代谢和ATP相关的呼吸减少，这表明iCCH肝细胞从线粒体呼吸作用产生ATP的能力下降（图4J）。同时通过肝细胞的四甲基罗丹明乙酯（TMRE）染色测定线粒体膜电位，在肝切除之前，与iWT相比，iCCH肝细胞的线粒体中TMRE信号无明显差异（图4K和4L）。但在肝切除36 h，iCCH肝细胞的TMRE信号相较于野生型减少很多（图4M和4N）。这些结果都证实了在肝再生期间，iCCH肝细胞的线粒体代谢反应显著降低。
转录组学和代谢组学整合分析揭示了CCH肝再生引起氨基酸代谢增加
为了解肝再生过程中代谢途径的全局变化并且深入了解其代谢变化，该研究使用QTOF质谱法进行了非靶向代谢组学分析，并且将RNA-seq和QTOF的数据放在一起进行整合分析。
WT与CCH的比较中，通过RNA-seq和代谢组学数据整合分析，结果表明12个途径在所有时间点均有显著改变，表明这些路径是细胞肥大或Cdk1缺失后特有的代谢路径（图5A）。与WT相比，CCH的次级代谢产物和碳水化合物的合成下调，但丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺代谢上调（图5B）。具有mRNA和代谢物的变化的图谱用以描绘再生肝脏的代谢组学的整体变化（图5C）。总体而言，氨基酸代谢包括富马酰乙酰乙酸水解酶（Fah）和精氨基琥珀酸合成酶1(Ass1) 的减少，此外，CREB，Jun，ERK，AKT和AMPK的信号通路也有所增加。
图5 代谢组学和转录组学的整合分析揭露了CCH肝再生过程的代谢重塑
此外，本研究通过LC-MS进行了靶向代谢组学分析（图5D-5I）。CCH中碳水化合物代谢衍生物略微减少，如己糖和磷酸烯醇丙酮酸（图5D和5E），ATP和GMP的水平没有太大的变化（图5F和5G），表明WT和CCH中能量持续不断得产生。这可能是由于存在其他的补偿途径，因为在一般情况下，存在其他途径可以补救减少的氧化代谢。为了证实这一猜测，对苹果酸和天冬氨酸的浓度进行了测定，它们在WT和CCH中水平相当，这可能是由于补偿途径的作用（图5H和5I）。同时，通过qPCR 测定了碳水化合物（图5J-5M）和氨基酸代谢(图5N和5O)中几种酶的mRNA表达，结果表明G6Pase水平在WT中相对恒定，而在CCH中36 h和168 h达到峰值， (图5J)。Pepck和Pfkl大约8 h达到峰值且随后减少(图5K和图5L), 而Pklr是丙酮酸激酶的肝脏同工酶，8-96 h显著降低（图5M），表明碳水化合物代谢可能减少。编码线粒体ALT（Gpt2） 和天冬氨酸转氨酶AST（Got1）的基因表达量在8 h达到峰值，随后在WT和CCH中再生期间降低，表明碳水化合物代谢相关酶表达减少的同时转氨作用相关酶的表达增加。
总之，这些实验结果表明，当肝细胞的细胞分裂减少时，肝NADH减少与氨基酸代谢的增加相关。这些结果表明只有产生于线粒体的NADH可能受到影响，因为氧化还原辅酶可来自其他代谢路径，例如苹果酸-天冬氨酸线粒体穿梭系统。最后，线粒体ALT表达的增加表明丙酮酸转氨酶可能在这一代谢重塑中起重要作用。
代偿性肥大细胞的肝再生导致丙酮酸通量的重塑
代谢组学和转录组学数据的生物信息学整合分析表明，CCH的肝再生过程中，生物氧化和碳水化合物代谢降低，丙氨酸和谷氨酰胺途径增强，这表明碳水化合物向谷氨酰胺利用的转变。因此，测量了AST、丙酮酸羧化酶+丙酮酸脱氢酶（PC + PDH）、乳酸脱氢酶和ALT的代谢通量，它们能分别将葡萄糖生成的丙酮酸转化为乳酸或丙氨酸（图6A）。在所有条件下，AST和PC + PDH均没有什么变化，表明乙酰辅酶A和天冬氨酸水平不受影响。在肝脏切除之前，与WT小鼠相比，CCH中LDH和ALT的代谢通量略微增加，表明两者的代谢通路是相当的(图6B和6C)。与WT相比，肝切除后36 h，ALT代谢通量显着增加(图6E),但LDH却没有增加。这表明CCH在肝组织再生期间，碳水化合物代谢物（丙酮酸）主要用于产生丙氨酸而不是乳酸。
图6 CCH肝脏再生中丙氨酸代谢增加了α-酮戊二酸和葡萄糖的产生
通过LC-MS测量肝再生期间不同时间点丙酮酸转化为丙氨酸和乳酸的相关代谢物。在WT中，α-酮戊二酸，乳酸，谷氨酰胺和谷氨酸的水平在肝再生过程中相当恒定，但丙酮酸和丙氨酸在后期略有下降（图6F）。在CCH中，丙酮酸，乳酸和谷氨酰胺是恒定的，但丙氨酸，α-酮戊二酸和谷氨酸明显增加。除丙氨酸外，在再生期间CCH肝脏中谷氨酸和α-酮戊二酸的含量也增加，这表明当线粒体不能有效工作时，用于合成代谢途径的谷氨酰胺的使用量增加。为了证实这一点，对氨基酸代谢的替代标记----血尿素氮（BUN）进行了测量。结果表明除了168 h，CCH小鼠中BUN均少于WT(图6H)，表明在CCH肝脏中线粒体氧化减少伴随ALT活性增强和丙氨酸的增加，并以此来以维持肝脏再生所需的合成代谢途径。
最后，探究了肝再生过程中ALT活性增强的潜在生理影响。肝脏中丙氨酸的主要功能是进行糖异生。因此，本研究探究了当线粒体代谢受损时， ALT活性的增强是否会影响葡萄糖的浓度。首先进行了丙氨酸耐量试验，在先前禁食的小鼠中注射了大量丙氨酸，并在腹膜内注射后的不同时间点测量了血液中的葡萄糖浓度。在WT小鼠中，丙氨酸注射对葡萄糖水平具有轻微影响，在肝切除后36 h后略微增加，在90 min内恢复正常。在肝切除前的CCH肝脏中，葡萄糖水平与WT相当。与WT小鼠相比有趣的是，在肝切除后36 h，丙氨酸注射后，CCH中血糖水平显著增加，注射120 min后葡萄糖浓度是初始水平的2倍（图6I）。
为了进一步验证这种效应是由ALT活性增强引起的，使用转氨酶抑制剂氨氧基乙酸半盐酸盐（AOA）阻断ALT活性。将AOA注射5天并在CCH和WT同窝小鼠中进行肝切除，然后在肝切除后36 h进行丙氨酸耐量试验。在CCH和WT小鼠中，葡萄糖水平保持不变，表明丙氨酸仅在ALT存在活性时才能够增加血糖浓度。
总结
本文通过转录组学分析、代谢组学分析和活体成像技术来描述肝脏再生的代谢变化，揭示了由线粒体功能受损和细胞氧化减少引起的代谢重塑，特别是当代偿性肥大细胞的肝脏再生时这一现象更加明显。本研究的直接临床意义是使用NAD+补充来调节NADH水平的可能性，以促进组织损伤后的肝细胞分裂或调节丙氨酸水平。