单细胞转录组分析揭示人肺纤维化病理机制

Single-Cell Transcriptomic Analysis of Human Lung Provides Insights into the Pathobiology of Pulmonary Fibrosis

前言

肺纤维化发病原因不明，带来了很大的社会经济负担。采用新技术揭示肺纤维化的分子机制对肺纤维化的精准诊断和治疗具有重要意义。使用全部肺组织的转录组分析将掩盖不同细胞群体变化的影响；而基于流式分选的细胞群体分析则需要事先对要研究的细胞marker有一些了解。单细胞测序技术能够克服以上研究技术的缺点，对已知和未知的细胞群体进行研究。

方法（或摘要）

对纤维化肺样本和健康肺样本进行了单细胞测序分析。发现在纤维化样本中一群特异的肺泡巨噬细胞可能与肺纤维化有关；与Wnt分泌和应答有关的基因主要在nonoverlapping细胞中表达；鉴定到稀有的气道干细胞和衰老细胞在肺纤维化过程中出现（结果部分明明说没有鉴定到？？）。

We identified a distinct, novel population of profibrotic alveolar macrophages exclusively in patients with fibrosis. Within epithelial cells, the expression of genes involved in Wnt secretion and response was restricted to nonoverlapping cells. We identified rare cell populations including airway stem cells and senescent cells emerging during pulmonaryfibrosis.

结果

对8例受体和 8例供体的肺样本进行scRNA测序分析，鉴定到各种细胞类群。分别在巨噬细胞、AT II 细胞、成纤维细胞中，对供体 VS 受体的细胞进行了差异表达和GO、GSEA通路分析；另外在bulk测序数据中，对纤维化 VS 对照组进行差异表达与通路分析。发现了一些与纤维化有关的细胞类型特异性生物过程和通路，另外发现纤维化细胞群在Comparative Toxicogenomics Database Pulmonary Fibrosis Gene Set 上存在显著富集。

动物模型的研究显示，肺纤维化可能与Notch、Wnt、EMT通路在肺部的异常激活有关。我们分析了这些通路中相关基因在不同细胞中的表达情况，结果发现（这部分感觉没什么结果，不知道作者绕来绕去究竟想说啥）。

发现肺纤维化特异的肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞

对每个样本的测序数据进行聚类和注释，而不是CCA整合分析（作者认为CCA分析会抹掉individual populations内部的异质性？？？），结果一共发现22种不同的细胞类型，比原来CCA整合分析多出来8种。

之前的动物模型研究显示，在肺纤维化组织中存在组织驻留型的巨噬细胞与单核衍生的促纤维化的巨噬细胞（ref 34，35）。我们把各个样本中的巨噬细胞放在一块进行聚类分析鉴定到4群巨噬细胞，其中C0为组织驻留巨噬细胞，表达MARCO、PPARG、MRC1；C1和C2主要来自于肺纤维化样本，高表达基因CHI3L1, MARCKS, IL1RN，PLA2G7，MMP9，SPP1，这些基因也在Pulmonary Fibrosis Gene Set中，应当与肺纤维化的发生有关。

同样的方法发现一群在肺纤维化样本中特异的AT II细胞，高表达一些与肺纤维化和免疫调控有关的基因（DMBT1，SERPINA1，CHI3L1）。之后采用原位RNA杂交对SPP1+巨噬细胞和CHI3L1+ AT II细胞进行了验证。

表达WNT配体与靶标的细胞是非重叠的

分析数据发现，表达WNT配体与靶标的细胞存在很少的重叠，且表达不同WNT配体的细胞也不重叠（所以是想说明啥？）。

稀有干细胞和衰老细胞

前人研究显示在肺泡损伤之后AT II 细胞有一类亚群高表达AXIN2，具有兼性祖细胞特性，与组织修复有关。然而在本研究的数据中未鉴定到这群细胞，暗示AT II 细胞可能是一个比较纯粹的群体。

衰老与一些特征性基因表达的变化有关，包括P16，P21，P53的诱导，减缓了细胞周期同时促进对细胞凋亡的抵抗；衰老同样导致相关分泌蛋白的表达，包括胰岛素样生长因子结合蛋白，白介素，TGF-β，纤溶酶原激活物抑制剂等。本研究中没有鉴定到表达衰老相关基因（CDKN2A，GLB1，SERPINE1，IL6）的特定细胞群。