学习小组Day7-----Lisa

啊，今天是学习小组的最后一天了。
今天不学习R语言，今天来看一下测序的相关知识吧。

现在的测序平台基本都是illumina公司出品的，Illumina市场规模占到75%以上，主打Hiseq，下面就主要介绍他的PE（Pair End双端）测序原理：

• 了解一下历史：

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• 首先了解一些必备名词：

flowcell： .测序板，测序反应的载体/容器，1个flowcell有8个lane
lane： 测序反应的平行泳道，试剂添加、洗脱等过程的发生位置
tile： 每次荧光扫描的位置，肉眼是看不到的
双端测序： 可能序列比较长有四五百bp，两边各测120-150bp
junction： 双端测序中间一些没有测到的区域
flowcell构造：一个lane包含两列（swath），每一列有60个tile，每个tile会种下不同的cluster，每个tile在一次循环中会拍照4次（每个碱基一次）

• Illumina测序一般流程:

（1）文库制备，将DNA用酶切或超声波随机片段化成几百碱基或更短的小片段。通过填充和核酸外切酶把DNA片段补成平末端，紧接着磷酸化并增加一个dATP核苷酸黏性末端。然后将Illumina测序接头与片段连接。
（2）簇的创建，将模板分子加入测序板 (flow cell) 用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道（lane）的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。一个Flow cell可以测定多个样品，我们可以一段barcode来区分不同样品（通常barcode存在与adaptor与测序片段之间）。所以如果你的样品较少，公司不会给你单独上机测序，要等样品足够多，一次性上机。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过桥式PCR不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段，该步骤将模板DNA扩增，具有一定扩增偏好性。
（3）测序，分三步：DNA聚合酶聚合带荧光且具有保护基团的NTP（可终止反应），荧光标记簇成像，保护基团被切除进行下一个循环。因为该测序方法先对插入片段的一端进行测序，其后对另一端进行测序，因此通常产出数据常为成对的reads.
（4）数据产出。

三代测序

• 总结一下第三代测序技术特点：

1、测序读长非常高。这与荧光标记位点与聚合酶效率有关。长的读长可以使得拼接更加准确，或者小的原核基因组基本不用拼接。
2、测序速度快。聚合酶效率高，一秒可以测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。
3、准确度非常高。可以达到99.9999%。
4、直接检测广泛的碱基修饰。实际上DNA聚合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者甲基化的C为模板，DNA聚合酶反应的停顿时间不同。根据这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。

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需要了解的太多了，这里收一些今后要看的网址：
1、生信小白第6天-初涉测序：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU4NjU4ODQ2MQ==&mid=2247483720&idx=1&sn=c28fe56afdbe788a65f98d79eae89189&chksm=fdf8490aca8fc01c4b5d4b4347cc31d78626f7d9a57c4fce10d74c011a836e583a5045f4a1bf&scene=21#wechat_redirect
2、生信小白第8天 名词结构化：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzU4NjU4ODQ2MQ==&mid=2247483729&idx=1&sn=05e5b864d97d0da43998999fc9f8d1fe&chksm=fdf84913ca8fc0050cea4e05cd95ef9ff66530ebd4bb287736912bd1b7f39cf25667421ee6e7&scene=21#wechat_redirect
3、测序技术原理及常用数据格式简介：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIzODU4Njc4MQ==&mid=2247484921&idx=1&sn=54fa0847e6e28567ad6ea5821ac3f394&chksm=e9365b0bde41d21d8a095b588c88705bd1e33fefc8b657ebff395b60a59836fce711a76da6ce&scene=21#wechat_redirect
4、测序的世界：https://www.jianshu.com/p/101c14c3a1d2
5、链特异性测序那点事：https://www.jianshu.com/p/8b177773ae38
6、测序原理-------一代测序、二代测序、三代测序：https://mp.weixin.qq.com/s?src=3×tamp=1584259370&ver=1&signature=PFcC4mO6h8DkI84Gtn7kAiRI8C85Aa1DJCPJZ9ZbLBClRmPDh9NRUu4tWduTFDgg2xvHm4aWg1UsXLB-23VfFn1w55WCEqEfUdAFUE3TWRjnhWNgPbJR4sLGSUrhJl-OiBgMCnOz3CU0y88-9BLaf83iajS8Q72KGmSBckc=
6、DNA 测序技术的发展：第三代测序法：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI1MzAyNDMyNg==&mid=400243721&idx=1&sn=cb9ea0261bab9ecdbf4651b1a5c452f7&scene=21#wechat_redirect
7、测序发展史：150年的风雨历程：https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzI5MTcwNjA4NQ==&mid=2247485298&idx=1&sn=36c8024abb89fd5f408578af06ef4313&chksm=ec0dc2f8db7a4beed246fffa24f0882bdfb02fa1b0b496a5701f65f799e603e8c09a1ddd8ff2&scene=21#wechat_redirect
8、原理介绍视频：https://share.weiyun.com/5qojuBY 密码： 密码：bxsry4

好啦，今天先整理这些，关于测序还是要一点点了解，从历史，到原理，到步骤，再到最后的数据分析。

革命尚未成功，同志仍需努力啊！