流式细胞术测定药物IC50

通常使用Annexin V-FITC / 7-AAD 对凋亡细胞进行染色，用流式检测阳性染色数，计算IC50。

本人最近在养HUVEC，并检测某种药物的IC50，记录一下步骤。在实验设计阶段，要设置一组只染AnnexinV的孔，和一组什么都不染的空，一定要设置对照组，溶剂组，并且溶剂组和对照组都要染AnnexinV/7-AAD。

1.正常消化细胞，收集细胞到5ml流式管内，350g 5min离心去上清。（离心可不用在细胞房进行）

2.加入200μL 预冷的PBS重悬细胞，并摇匀，再次350g 5min离心去上清；（清洗细胞）

3.加入200μL 1乘的binding buffer（按照说明书配好，本人用的四正柏）再洗一次，注意摇匀，再次离心去上清。

4.加入100μL 1乘的binding buffer重悬，摇匀，吸100μL到96孔板（不同浓度，不同复孔都要换枪头），加入5μL 的Annexin V-FITC，避光孵育5min。（不同牌子避光孵育时间不一样）

5.按照每孔4μL 7-AAD和100μL PBS配置好溶液，当避光孵育结束后，每孔加入104μL的溶液，立即上机检测。本人用的流式是guava，一次性检测所有孔，中间不能改电压。

6.测定结束后，可以使用仪器直接画IC50的图，也可以使用graph pad计算IC50