抑制STAT5信号会影响骨肉瘤的生长和干性
Suppressing STAT5 signaling affects osteosarcoma growth and stemness
摘要
研究表明JAK/STAT信号的失调促进了骨肉瘤（osteosarcoma，OS）的进展。匹莫齐特（pimozide，别名哌迷清），一种STAT5抑制剂，抑制了骨肉瘤细胞的增殖和克隆形成，并诱导了G0/G1期细胞阻滞和凋亡。cyclin D1和CDK2表达水平、Rb磷酸化和caspase 3、PARP的裂解减少。另外，匹莫齐特抑制了肺类器官体系中三维培养的骨肉瘤球状培养物的形成与细胞的生长。而且，癌症干细胞标记物蛋白DCLK1、CD44、CD133、Oct-4和ABCG2的表达减少了。更重要的是，是DCLK1短亚型在骨肉瘤球状物中上调了，而用匹莫齐特处理后受到了抑制。作者进一步用流式细胞术确认了DCLK1+细胞数量的减少。而且，匹莫齐特抑制了OS细胞中STAT5、STAT3和ERK的磷酸化。分子对接研究证实，匹莫齐特与STAT5A和STAT5B的结合能量分别为-8.4和-6.4 Kcal/mol。这种分子结合通过细胞热转移分析（CETSA）得到了验证。为了进一步理解STAT5的作用，作者用siRNA敲降了它的两种亚型，使用匹莫齐特腹腔注射治疗荷瘤小鼠（KHOS/NP肿瘤异种移植）21天。匹莫齐特治疗显著抑制了异种移植物的生长。WB和免疫组化分析也证明了干细胞标记蛋白受到了显著抑制。综上，这些数据表明，匹莫齐特治疗至少是部分通过抑制STAT5信号通路，靶向增值的肿瘤细胞和肿瘤干细胞，从而抑制了OS生长。
主要结果
图1 匹莫齐特抑制骨肉瘤生长。 (A) 匹莫齐特的化学结构。(B) 用浓度逐渐（0–40 μM）增加的匹莫齐特培养KHOS/NP、MG63和SJSA-1细胞，并测定细胞增殖。与对照组相比，匹莫齐特治疗导致所有细胞都呈现显著的剂量和时间依赖性的细胞增殖减弱。(C)KHOS/NP、MG63和SJSA-1细胞用10 μM匹莫齐特处理48小时后，用于生长并形成细胞群落（就是克隆形成实验，翻译出来怎么怪怪的...）。匹莫齐特处理抑制了细胞群落形成。图为三次独立实验的代表性结果。(D-E) 20 μM 匹莫齐特特异性抑制KHOS/NP GFP阳性细胞，但是不抑制TiD体系（tumor-in-a-dish，是作者团队此前构建的一种多细胞类型的肺类器官模型，这个TiD类器官包含永生性的上皮细胞和成纤维细胞，以及内皮细胞，因而创造了一个类似体内的肿瘤微环境，为OS细胞提供了必要的细胞-细胞接触、组织结构和不同细胞类型的影响）中的正常细胞。比例尺：100 μm。
图2匹莫齐特诱导细胞周期阻滞和凋亡。（A）匹莫齐特处理细胞后进行周期分析。用20 μM匹莫齐特处理KHOS/NP和SJSA-1细胞24小时和48小时，之后用碘化丙啶（propidium iodide，PI）对DNA染色后上流式细胞仪检测。两种细胞中，匹莫齐特处理24小时和48小时都增加了G0/G1期阻滞。（B）用匹莫齐特（10和20 μM）与孵育细胞24小时后，通过测定caspase-3/7活性来评估细胞凋亡。匹莫齐特处理导致两种细胞中的caspase-3/7活性都显著增加（*p < 0.001）。（C）用20 μM的匹莫齐特处理细胞24和48小时，用WB细胞裂解物中caspase 3和PARP蛋白表达。两种细胞系均显示，在匹莫齐特处理后出现了caspase 3和PARP裂解。（D）经20 μM匹莫齐特处理的细胞的裂解产物用WB分析cyclin D1、CDK2和RB（成视网膜细胞瘤基因，DNA结合蛋白。在细胞周期的G1期，Rb蛋白在被Cyclin-CDK（一般是CyclinD/CDK4 or CyclinE/CDK2）磷酸化后变成p-Rb，然后才可以释放结合在其上的E2F，E2F是转录因子，促进S期所必需的Cyclin（细胞周期蛋白）、CDK蛋白的转录，细胞才能从G1期进入S期）磷酸化水平。匹莫齐特抑制了两种细胞系中cyclin D1、CDK2表达以及RB磷酸化水平。（E）用20 μM匹莫齐特处理24和48小时后，细胞裂解产物用WB分析抗凋亡和促凋亡蛋白。匹莫齐特处理导致了KHOS/NP和SJSA-1细胞中Bcl2和Bcl-XL表达的下降和Bax表达水平的上升。
图3匹莫齐特影响癌症干细胞标记物表达。（A）在低粘附培养板中，将KHOS/NP和SJSA-1细胞培养在特异的球状体培养基中，并用0–25 μM的匹莫齐特处理。5天后，对球状体进行拍照并计数。比例尺：100 μm。（B）收集原代的细胞球并分离成单细胞，然后重新铺板。匹莫齐特处理显著抑制了骨肉细胞球体形成（*p < 0.05）。（C-D）与二维培养相比，三维培养物的裂解产物用WB分析显示，两种细胞系中的DCLK1短亚型都显著升高。匹莫齐特抑制了DCLK1该亚型的表达。三维培养物的裂解物的WB分析结果显示，与二维培养相比，两种细胞系中显著升高的CD44、CD133、Oct-4和ABCG2水平被匹莫齐特有效地抑制了。（E）KHOS/NP和SJSA-1细胞中抗-DCLK1抗体标记的藻红蛋白（phycoerythrin）的流式细胞分选。24小时后，匹莫齐特处理导致了DCLK1阳性细胞数量的显著降低。
图4 匹莫齐特抑制STAT5磷酸化。（A）匹莫齐特与STAT5相互作用。通过分子对接测定出匹莫齐特可以与STAT5A和STAT5B的SH2结构域互作，结合能量分别为−8.4 和−6.4 kcal/mol。（B）细胞热转移实验（cellular thermal shift assay，CETSA：该方法依据的原理是，靶蛋白在结合配体药物分子后增加了结构的热力学稳定性[1]）。用匹莫齐特处理KHOS/NP细胞，再用差异温度处理3分钟。最终的裂解产物用WB检测其中的STAT5。匹莫齐特保护了STAT5，使其避免了热变性，证明匹莫齐特与STAT5的相互作用。（C）匹莫齐特处理后的细胞的裂解产物引起了STAT5、STAT3和ERK磷酸化的显著减少。
图5 STAT5保护细胞避免匹莫齐特街道的细胞死亡.（A）用siRNA干扰STAT5A、STAT5B或者同时干扰两者，处理72小时。裂解物中STAT5用WB分析。敲降STAT5A或者STAT5B减少了STAT5蛋白的水平，其中，干扰STAT5B产生的影响更明显。（B）转染siRNA干扰STAT5A和STAT5B的或者同时干扰两者，处理48小时，随后用PI染色后用流式细胞术分析细胞周期。敲降STAT5蛋白不影响骨肉瘤的细胞周期进程。（C）siRNA干扰STAT5A、STAT5B或者同时干扰两者，再用10 μM匹莫齐特处理。己糖胺酶试验测定细胞增殖发现，敲降STAT5减弱了骨肉瘤细胞增殖。（D）siRNA干扰STAT5A、STAT5B或者同时干扰两者，处理48小时后用10 μM匹莫齐特处理24小时。WB分析裂解产物中STAT5和capase 3水平。敲降STAT5A或者STAT5B进一步增强了匹莫齐特介导的caspase 3裂解。（E）siRNA干扰STAT5A、STAT5B或者同时干扰两者，再用匹莫齐特处理。Annexin V/PI染色后用流式细胞仪分析。匹莫齐特处理显著诱导了细胞的坏死和晚期凋亡。然而，STAT5B的敲降减少了匹莫齐特介导的坏死，但导致了凋亡的进一步增加。
图6 匹莫齐特抑制KHOS/NP骨肉瘤异种移植物的生长. （A）实验计划。（B）KHOS/NP细胞注射进裸鼠侧腹部位，经7天时间形成明显可见的瘤体。随后，每天用匹莫齐特（10 mg/kg体重）腹腔注射，持续21天。每周测量瘤块大小。第22天，切除瘤块并作进一步分析。（C）匹莫齐特处理没有减少了动物体重。 （D）匹莫齐特治疗的小鼠的瘤块肿瘤比对照组的更小（*P < 0.004）。（E） 匹莫齐特显著减少了肿瘤体积（*P < 0.001）。误差线代表±SEM，每组5只小鼠。*P < 0.05，Student’s t检验。
图7 匹莫齐特抑制肿瘤异种移植体组织中cyclin D1、癌症干细胞标记物和STAT5信号蛋白。（A）WB（C1-4为对照组肿瘤异种移植物组织，P1-4为匹莫齐特治疗的异种肿瘤移植物）和（B）免疫组化分析表明，在匹莫齐特治疗的动物的组织裂解物中，cyclin D1表达水平显著更低。比例尺：40 μm。（C）WB（C1-4为对照组肿瘤异种移植物组织，P1-4为匹莫齐特治疗的异种肿瘤移植物）和（D）免疫组化分析表明， 在匹莫齐特治疗的动物的组织裂解物中，癌症干细胞标记物DCLK1、CD44和ABCG2的表达水平显著更低。比例尺：40 μm。（E）WB（C1-4为对照组肿瘤异种移植物组织，P1-4为匹莫齐特治疗的异种肿瘤移植物）和（F）免疫组化分析表明，在匹莫齐特治疗的动物的组织裂解物中，STAT5的磷酸化水平显著更低。比例尺：40 μm。
老编简评
总体来说，这个文章是思路其实比较传统，似乎并没有什么高大上的东西。使用的方法除了细胞热转移分析（CETSA）这个手段，其他的也没有啥特别的。使用的工具方面，个人觉得类器官是这个研究的亮点了。而且，他们的这个类器官不是直接用骨肉瘤组织或者骨肉瘤干细胞直接制备的类器官，而是用越1000多个人正常肺上皮细胞、正常肺成纤维细胞、脐静脉内皮细胞和正常淋巴管内皮细胞与KHOS/NP GFP阳性细胞共同混合后培养形成的。但是话说回来，为什么不直接做骨肉瘤类器官呢？因为不是很好做？这个类器官仅仅是用来证明匹莫齐特对正常细胞没啥影响？有点大材小用了。
带着这个问题，我找了一些资料发现，骨肉瘤复发率和转移率都非常高，而且最容易转移到肺部。骨肉瘤类器官的研究报道还非常少，目前只发现一篇，而且也是主要研究肺转移的骨肉瘤样本制备的类器官，原位骨肉瘤样本仅有一例[2]（这个文献考虑下期讲解）。在这个研究中作者发现Cut/EnBloc法难以培养出原位骨肉瘤来源的类器官。虽然作者说用单细胞法可以制备出相应的类器官，但是根据老编的浅薄认识，那个就算是类器官，生长状态也是很糟糕的。基于这些信息，我的猜测是很多骨肉瘤确诊时已基本发生转移，而且原位骨肉瘤类器官培养失败率很高，所以在今天讲解的这个文献中，作者采用了大杂烩型的类器官把KHOS/NP骨肉瘤细胞包裹起来，来研究匹莫齐特在体内的可能的效果。
另外，关于荷瘤实验，不是说直径超过2厘米的瘤块就违反伦理了吗？那个瘤体起码直径超过5厘米了吧？这么肥美是怎么回事？！（有同样质疑的，可以发个邮件给杂志社，看看会不会撤稿？）
更多内容请下载原文查阅：
https://sci-hub.ren/10.1038/s41419-020-2335-1
参考文献
1. Molina D M, Jafari R, Ignatushchenko M, et al. Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay[J]. Science, 2013, 341(6141): 84-87.
2. He A, Huang Y, Cheng W, et al. Organoid culture system for patient-derived lung metastatic osteosarcoma[J]. Medical Oncology, 2020, 37(11): 1-9.