易基因｜m5C甲基化研究揭示mRNA m5C对维持果蝇生殖干细胞发育的分子机制

2020年02月18日，Stower研究所解亭教授团队与南方科技大学李思思团队合作研究发现果蝇的YPS蛋白通过优先结合带有m5C修饰的RNA，从而促进果蝇卵巢生殖干细胞的发育。该成果以“Drosophila YBX1 homolog YPS promotes ovarian germ line stem cell development

by preferentially recognizing 5-methylcytosine RNAs”为题在线发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）（IF 11.205）期刊上。

摘要：

m5C是一种存在于tRNA和rRNA中的RNA修饰，最近在mRNA中发现。虽然有人提出m5C RNA修饰可以调节多种生物学功能，但m5C RNA修饰是否会影响成体干细胞发育尚不清楚。在本研究中，研究人员发现YPS蛋白（Ypsilon schachtel）是人Y-框结合蛋白1(Y box binding protein 1 ,YBX1)的人源同类蛋白，可以通过优先结合带有m5C修饰的RNA，从而促进果蝇卵巢生殖干细胞（GSC）的维持、增殖和分化。遗传学证明YPS在果蝇卵巢中具有GSC维持、增殖和分化功能，人YBX1可以在功能上替代YPS支持GSC正常发育。YPS和YBX1的保守冷休克结构域（cold-shock domains,CSD）在体外优先与m5C RNA结合。此外，YPS还优先与生殖细胞中带有m5C修饰的RNA（包括mRNAs）结合。YBX1 CSD-RNA复合物的晶体结构表明，疏水相互作用和氢键对m5C结合至关重要。RNA结合缺失突变YPS和YBX1蛋白表达会阻碍GSC发育。综上所述，研究结果表明m5C RNA修饰在成人干细胞发育中起着重要作用。

背景：

近几年，由于表观转录组学的兴起，m5C作为mRNA中除m6A之外另一种广泛存在的修饰，引起了研究人员们的关注。然而，其调控细胞发育和分化机制的机理目前尚不清楚。

研究材料：

室温条件下，在标准玉米粉/糖蜜/琼脂培养基上饲养和杂交果蝇。为最大限度提高shRNA和转基因的表达水平，在分析卵巢表型之前，将新羽化的果蝇在29°C条件下培养2周。取卵巢组织分离RNA用于研究。

结果：

（1）YPS促进果蝇卵巢的GSC维持，增殖和分化

研究人员们首先发现YPS蛋白缺失的2周龄果蝇卵巢干细胞显现出发育延迟，增值变慢的现象，提示该蛋白对于果蝇生殖干细胞的维持，增殖以及分化具有重要作用。由于YPS的人源同类蛋白YBX1与mRNA

m5C甲基化酶NSUN2共定位于外泌体中，且YPS本身含有能够结合核酸的保守的cold-shock结构域，研究团队推测YPS可能通过结合含有甲基化的mRNA来行使功能。

图1：YPS本质上是为了促进GSC维持、增殖和分化  

（2）人YBX1可以在功能上取代YPS，促进果蝇卵巢GSC发育

为了验证推测，研究团队首先在YPS缺失的果蝇生殖干细胞中回补表达人源的同类蛋白YBX1，发现YBX1可以替代YPS促进果蝇生殖干细胞正常发育，证明两个同源蛋白在功能上具有保守性。同时通过Flag-pulldown，免疫共沉淀以及高通量测序的方法发现YPS确实能在体内结合更多含有m5C修饰的mRNA。

图2：YPS优先与生殖细胞中带有m5C修饰的RNA结合

（3）YBX1-CSD主要通过疏水相互作用对带有m5C修饰的RNA优先结合

研究人员利用ITC以及蛋白晶体结构解析等技术，对比YBX1蛋白结合甲基化修饰的RNA以及非甲基化修饰的RNA的高分辨率复合物结构，发现在YPS和YBX1中高度保守的4个氨基酸（Trp65、Phe74、Phe85、His87）对于识别和结合甲基化修饰的RNA至关重要。其中，RNA甲基化增强了RNA与蛋白之间的疏水相互作用，确保YPS和YBX1在体内与甲基化的RNA具有更高亲和力。

图3：果蝇YPS和人YBX1的CSD优先与带有m5C修饰的RNA结合

（4）RNA结合缺失突变YBX1和YPS蛋白表达严重打乱GSC发育

功能实验证明，当将这些关键位点进行缺失突变之后，YBX1无法与RNA结合。不能结合RNA的YPS突变体W65A，F74A以及F85A表现为显性失活，会打乱果蝇生殖干细胞的发育。结果表明，YBX1和YPS中的Trp65，Phe74和Phe85对其体内功能至关重要。

图4：RNA结合缺失YPS和YBX1突变的种系特异性表达严重干扰GSC发育

易基因小结：

本研究结果表明，YPS通过优先识别带有m5C修饰的RNA来调节翻译、剪接和稳定性，从而促进果蝇卵巢中GSC的发育，揭示了其作为mRNA m5C的结合蛋白来影响生殖干细胞发育的分子机制。同时，由于YPS/YBX家族蛋白功能从果蝇到人类都是保守的，研究验证了人源YBX1蛋白可以替代果蝇YPS蛋白在果蝇卵巢干细胞中的作用，暗示其可能在人类干细胞中具有类似作用，果蝇卵巢或许可以分析人YBX家族蛋白和m5C修饰在生殖细胞发育中的功能，为未来的人类干细胞治疗提出了可能的研究方向。

此前，易基因对斑马鱼m5C修饰在生理和病理进程中的重要调控作用、单碱基分辨率下分析人类膀胱尿路上皮癌(UCB)样本中mRNA的m5C修饰、m5C修饰在哺乳动物mRNA出核和转录后调控中发挥重要作用、重亚硫酸盐处理结合高通量NGS策略，单碱基分辨率检测人细胞(h)m5C修饰分布等m5C研究成果进行了解读：m5C

RNA甲基化测序技术---从mRNA到全转录组（mRNA+lncRNA+tRNA）m5C单碱基分辨检测，期待更多m5C甲基化修饰功能调控研究成果。

关于m5C甲基化测序

适用于不同科研需求的m5C甲基化测序技术：

常规mRNA m5C甲基化测序（RNA-BS）：

mRNA分离后首先通过亚硫酸盐处理，非甲基化的C转变为U，m5C修饰的碱基保持不变，结合高通量测序，可以对RNA上的每一个C碱基修饰进行定位与定量。

常规mRNA +lncRNA m5C甲基化测序（lncRNA-BS）：

建立的升级版m5C RNA甲基化测序服务，去除人rRNA后，剩余RNA经重亚硫酸盐处理后，结合高通量NGS策略，可在全转录组范围内单碱基分辨率地检测基因m5C甲基化修饰分布。

技术优势：

高深度：超高深度重亚硫酸盐处理，检测准确性极高；

高通量：结合高通量NGS，全转录组范围内检测；

单碱基：单碱基分辨率，快速检测和分析RNA中的m5C。

高准确：精确的检测mRNA等每一个C碱基的的修饰水平。

研究方向：

与m6A甲基化类似，m5C甲基化已被证明与肿瘤、神经系统紊乱、代谢性疾病、病毒感染以及个体发育等密切相关。

此外，RNA甲基化（m5C）与人类疾病密切相关，其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。

参考文献：

（1）       [endif]doi: 10.1073/pnas.1910862117.

（2）       [endif]南方科技大学：https://science.sustech.edu.cn/portal/Article/index?id=504&cid=10&year=2020&nav_id=95