上期给大家介绍了T4SS的生物学功能以及研究方法，Type IV secretion system：T4SS知识介绍1；T4SS的的底物类型及转移方式，Type IV secretion system：T4SS知识介绍2
今天小编给大家介绍IV分泌系统的四种IV分泌系统研究模型
模型革兰氏阴性细菌T4SSs结构-功能关系知识的进展
包括类似于根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）VirB/VirD4 T4SS的“最小化”系统和由幽门螺杆菌Cag（ Helicobacter pylori Cag），嗜肺军团菌 (Legionella pneumophila) Dot/Icm代表的“扩展”系统和F质粒编码的（F plasmid-encoded） Tra T4SS。
根癌土壤杆菌VirB/D system
T4SS最少由一组保守的亚基组成。在革兰氏阴性菌中，需要约12个亚基来构建功能齐全的“最小化”系统。根据来自典型根癌土壤杆菌VirB/VirD4 T4SS的T4SS超家族的统一命名法，这些被命名为VirB1至VirB11和VirD4。
VirB1 蛋白是一种双功能蛋白质，它一方面可以在 T4SS 装配位点降解宿主细胞壁肽聚糖，方便 T4SS 插入宿主细胞，另一方面，VirB1 通过与菌毛亚单位的相互作用促进菌毛形成；
蛋白VirB 形成一个菌毛结构的跨膜分泌通道，从细菌内膜延伸跨过外膜通向胞外环境。这个菌毛结构主要由大部分的 VriB2 亚单位和少部分的 VirB5 亚单位共同组成一个具有完整功能的分泌通道；
蛋白VirB3和VirB7为菌毛相关蛋白；蛋白VirB6- 10 为跨膜通道的组分，存在于周质，内膜和外膜中，并形成分泌通道及其辅助蛋白；VirB4，VirB11和VirD4定位于内膜并作为为系统供电的ATP酶。
三种ATP酶（VirD4，VirB4，VirB11）构成位于易位通道底部的细胞质能量中心。在这些ATP酶中，VirD4在进入易位通道之前充当DNA和蛋白质底物结合的受体。蛋白VirB4 和 VirB11 是为转运提供能量的 ATPase；而蛋白 VirD4 是被称为“ 伴侣 蛋白 ” 的另一个 ATPase，它的作用在于将要转运的 DNA 呈递给分泌系统的其他组分。
通道本身由两个子组件组成，一个组件跨越内膜（IM），另一个组件位于周质和外膜（OM）中。IM复合物（IMC）最少由VirB3，VirB6，VirB8和VirB10的N-末端区域组成。与通道稳定结合的VirB4 ATP酶也被认为是IMC的一部分。IMC通过茎或圆柱体连接到外膜核心复合物（OMCC），其最小程度地由脂蛋白VirB7，VirB9和VirB10的C末端结构域组成。
嗜肺军团菌Dot/Icm
Dot/Icm系统是目前研究最深入的T4SS之一。TDot/Icm系统已被确认存在于嗜肺军团菌和伯纳特立克次氏体中。嗜肺军团菌是一种兼性胞内寄生菌，可入侵变形虫，或是人类的巨噬细胞。嗜肺军团菌使用T4SSDot/Icm定殖人肺泡巨噬细胞，引发称为退伍军人病(Legionnaire’s disease)的严重肺炎。4SSDot/Icm在感染期间转移超过300种蛋白质效应物，其中许多已显示靶向控制膜转运过程。T4SSDot/Icm还保留了将可移动元件的IncQ质粒RSF1010转移至受体细菌的作用。
嗜肺军团菌T4BSS与T4ASS的相似性非常有限，但T4BSS的基本结构与T4ASS相似。T4BSS由大约27个Dot/icm基因组成，编码22种结构蛋白和5种与细菌细胞质中效应蛋白相互作用的伴侣蛋白。
Dot/Icm T4SS是嗜肺军团菌发病机制所必需的关键毒力因子，并将效应蛋白转运到宿主细胞质中，使嗜肺军团菌能够操纵多种细胞过程，包括膜运输，蛋白质合成，泛素化和自噬。
为了逃避宿主的杀死，嗜肺军团菌将吞噬体转化为称为含军团菌液泡（LCV）的保护隔室，其形成需要T4SSDot/Icm。嗜肺军团菌被肺泡巨噬细胞吞噬后，在吞噬体成熟前期， 通过抑制吞噬体 - 溶酶体融合，因而细菌不被溶解得以存活。嗜肺军团菌的Dot/Icm T4SS系统将粗面内质网和吞噬体构成一个小室，以供细菌在此大量繁殖，与细菌毒力密切相关。此外，嗜肺军团菌的 Dot/Icm T4SS 系统还可促宿主细胞凋亡以及细菌从吞噬体中的逃逸。
Dot/Icm系统通道优先组装在嗜肺军团菌细胞的两极，实际上，极性定位对于T4SS在感染过程中的功能至关重要。然而，即使在固定相中生长的细胞也具有横向的Dot/Icm系统。横向Dot/Icm系统可能对应于组装中间体。T4SSDot/Icm组装途径的是由两种蛋白质DotU和IcmF负责T4SSDot/Icm的极性靶向。
通过透射电镜观察、原位冷冻和荧光显微镜也进一步阐明了OMCC和IMC的结构和动态活动。OMCC呈现为由DotC，DotD，DotF，DotG和DotH亚基组成的直径为400埃的“Wi-Fi”状结构，而且OMCC在宽度（~400Å）上近似于Cag系统，但在高度仅为~165Å。它由五个亚单位组成，其中DotD、DotH和DotG是VirB7、VirB9和VirB10的功能对应物，DotF和DotC是系统特异性的。 在OMC内DotC、DotD、DotH、DotK和Lpg0657分别以1:2:1:1:1的化学计量比存在。OMC和PR表现出对称性失配，但在这种情况下OMC具有13重对称性，周质环（periplasmic ring，PR）具有18重对称性。DotK和Lpg0657具有类似肽聚糖结合域的折叠，但在两种蛋白的结合缝隙中均未观察到肽聚糖。
IMC主要由IM蛋白DotG、DotF、ATP酶DotO和DotB 构成；DotO采用与VirB4相似的二聚体排列的六聚体，DotO呈现为两个直径与由CagE形成的I环和M环大致相同的同心环.I环底部的六聚环被假定为对应于类VirB11的DotB。
the H. pylori Cag T4SS (T4SSCag).
T4SSCag系统主要存在于幽门螺杆菌中，以在感染期间将底物附着并转移到人胃上皮细胞中，类似于革兰氏阴性细菌接合系统和根癌土壤杆菌VirB/VirD4 T4SS，其产生接合菌毛以促进附着。
这些底物不仅包括CagA'癌蛋白'，还包括染色体DNA，肽聚糖和D-甘油-b-D-甘露-庚糖1,7二磷酸（D-glycero-b-D-manno-heptose 1,7bisphosphate ，HBP），它是LPS代谢物。
CagA的易位诱导真核靶细胞的各种变化，包括但不限于细胞骨架改变和细胞极性和粘附的变化，细胞-细胞连接的破坏以及增加的细胞运动性和细胞迁移。T4SSCag介导的HBP易位涉及NF-kB途径的激活，因此HBP被指定为新的病原体相关分子模式或PAMP。然而，在最近的更新中，幽门螺旋杆菌显示产生HBP的水平太低而不能解释NF-κB活化。相反，HBP的衍生物ADP-甘油-β-D-甘露庚糖（ADP-glycero-β-D-manno-heptose，ADP heptose）被鉴定为负责幽门螺杆菌诱导的人上皮细胞中NF-κB活化的关键PAMP。
CagA分泌底物位于Cag菌毛的尖端；CagL及其同系物VirB5都定位于各自的菌毛上并且涉及靶细胞结合；然而，奇怪的是，产生接合菌毛所需的VirB2菌毛蛋白和VirB10亚基的直系同源物CagC和CagY对于Cag菌毛是不必要的。据报道，幽门螺杆菌拥有大的鞘管结构，其与Cag菌毛的关系尚未确定。在接合系统中，没有直接证据表明DNA或蛋白质底物在接合菌毛内或附着于接合菌毛。因此，与T4SSCag的接合性质以及Cag菌毛和鞘管的功能作用仍在研究中。
最近的报道定义了OMCC的三维结构，分辨率高达3.4Å。OMCC具有三种不同的结构特征，由外层（O层）和内层（I层），周质环（periplasmic ring，PR）和茎组成的外膜帽（outer membrane cap，OMC）。最引人注目的是，OMC（14重对称）和PR（17重对称）之间存在明显的对称失配。OMCC由CagX和CagY各14个拷贝，CagM和CagT 28个拷贝和Cag3 70个拷贝组成，即5种组分（CagX，CagY，CagM，CagT，Cag3）的化学计量比为1:1:2:2:5。该结构证实了CagX和CagY都构成OMC和PR的一部分，从而弥合对称失配的事实。值得注意的是，T4SSs的两个高度保守的核心亚基VirB9和VirB10跨越OMCC的两部分，在“最小化”系统中具有相同的14倍对称性，但在T4SSCag中具有14倍和17倍对称性。
原位CryoET检测到的T4SSCag的IMC结构成份。T4SS系统结构有一个中央通道，CagA和其他底物可能通过这个通道进行转运。IMC由三个直径分别为~12，~22和~36 nm的同心环组成，分别表示为I环，M环和O环。首先，CagE通过先组装成二聚体后形成的六聚体来对I环和M环进行组装，二聚体有助于I环和M环的一部分。其次，类似VirB11的Cagα通过与CagE直接接触而与I环的细胞质面稳定结合。类似VirD4的Cagβ有助于O环的形成以及I环和M环的细胞质延伸。值得注意的是，这是第一个可视化的T4SS的ATP酶能量中心，其中所有三种ATP酶都清楚地作出结构贡献。总体而言，T4SSCag序组装途径是有序的，其中OMCC首先组装，然后成核IMC的整体膜部分的组装。ATP能量中心通过由CagE，Cagα和Cagβ在IMC的细胞质基部组装.最后，一个或多个未指明的成分通过与Cagβ和可能的一个或两个其他ATP酶的接触进行组装。
F质粒编码的Tra T4SS系统（F plasmid-encoded Tra systems ）
T4ss系统的基本机理和结构特性的理想模型，易于遗传操作，目前唯一已知拥有动态延伸和缩回的F菌毛的T4ss。F菌毛是延伸到细菌细胞外空间以介导与靶细胞附着的细丝。附着后，F菌毛缩回以将两个细胞拉在一起，允许建立直接的细胞-细胞接触，并最终建立SDS-和抗剪切的“交配连接”(SDS- and shear-resistant ‘mating junction’)。先前的研究确定F菌毛由数千个作为螺旋组装体聚合的TraA（菌毛蛋白）分子组成。
对 T4SS 的研究最早始于1946年，Lederburg 和 Fatum 发现大肠杆菌F质粒接合系统。大肠杆菌的 F质粒接合系统，参与细菌遗传物质从供体细胞到受体细胞的转移。
T4SS Conjugation systems
质粒是自主复制位于细菌细胞质中的环状DNA分子。四分之一的质粒是接合质粒，另一个四分之一对应于可动员质粒，最后，所有质粒的一半是不可移动的质粒。结合和可移动的质粒一起构成所谓的可传播质粒。
结合质粒很小（20–200kb），自我复制的双链环状DNA分子，能够通过复制到另一种细菌菌株或物种中编码其转移。
可移动质粒是携带形成全部或部分松弛体所需的DNA转移基因的质粒，但缺乏交配孔形成所需的基因
通常，质粒提供细菌存活的有利特性和能力，例如对杀菌和抑菌抗生素的抗性。根据不相容性组（Inc）对质粒进行分类，使得同一组的两个质粒不能在同一细菌细胞内同时共存。一些Inc组（例如，IncN，IncP和IncW）可以在许多不同的细菌物种中发现；相反，其他（例如，IncF和IncI）只能稳定地保存在特定的细菌物种中）。接合和可移动质粒分别含有参与缀合过程的全部或部分基因。
接合相关基因分为两个模块：MOB（迁移率）和MPF（交配对形成）基因。接合质粒具有两个模块，因此具有编码HGT所需的所有蛋白质的基因。
MOB模块，以前称为DNA转移和复制Dtr proteins（DNA transfer and replication proteins），由底物处理所需的三个序列组成。
首先是oriT（转移起点）序列，它标志着DNA加工的起点。
其次，编码特异性识别其质粒的oriT序列的松弛酶的序列。松弛酶是所有可传播质粒中唯一的保守蛋白。
MOB模块中编码的第三种蛋白质是T4CP，其识别细胞质基质中的松弛体并将其与位于膜中的分泌通道连接。同样，参与松弛体加工的辅助蛋白也可以在MOB模块中找到。
另一方面，MPF模块编码构建T4SS的蛋白质（在T4AS的情况下为VirB1-11）。
T4SS 接合系统
A、 T4SS通道，接合菌毛和松弛体的组装。松弛体（由松弛酶，DNA和辅助蛋白组成）在细胞质中形成
B、 预起始复合物的形成（pre-initiation complex）
一旦菌毛，T4SS和松弛体形成，相互作用形成预起始复合物，一直保持至接合开始。
松弛体由T4CP通过各种相互作用聚集。尽管已知松弛酶在其T4CP识别序列中具有转移信号，T4CP与附着于分泌通道的VirB4产生六聚或异六聚体。DNA与T4CP的结合以及随后与T4SS的相互作用似乎触发了T4CP和类VirB11蛋白对ATP的水解。这些过程诱导VirB10的构象变化，从而激活分泌通道。
C、 激活接合过程。
尽管由DNA结合和ATP水解引起的细胞内信号对于底物转移是必需的，但也需要细胞外信号。当菌毛识别受体细胞时产生该细胞外信号。一旦受体菌与，菌毛就会缩回（F型）或下降（P型），形成两个细菌细胞之间的连接。此外，由于VirB10蛋白和T4CP之间的一系列相互作用，识别信号通过T4SS转导至细胞质。结果，松弛酶切割DNA链共价连接至5'端。此外，DNA复制以滚环复制的形式发生，从游离3'端形成DNA链。
D、 底物通过T4SS传输。
底物由与ssDNA共价结合的松弛酶组成。为了转移具有这种不同特征的复合物（即蛋白质和核酸），T4SS需要在接合期间经历实质性变化。在这个问题上，许多问题仍未得到解答，例如，哪个组件首先转移？松弛酶如何展开和转移？根据转移DNA免疫沉淀（TrIP）测定，ssDNA从T4CP转移至VirB11而无需能源成本，然后，将底物转移至VirB6和VirB8蛋白。此时，ATP酶需要活跃以产生所需的能量；接下来，底物从VirB8转移到VirB9，最后转移到菌毛中的VirB2。最初，提出了一步和两步模型。在第一个模型（一步）中，ssDNA底物将直接转移到T4SS，而在第二个模型（两步）中，ssDNA底物将从T4CP通道转移到细胞周质，并从那里转移到T4SS。在任何情况下，由于细胞周质中存在高含量的核酸酶，该第二模型已被丢弃。相反，有人建议将T4CP放置在T4SS的入口处，将底物直接转移到T4SS。已经提出了针对ssDNA底物的三种可能的转移途径：（i）通过T4CP六聚体的通道转移至T4SS；（ii）在其被T4CP摄取后，底物可以通过VirB4六聚体并从那里转移到T4SS；或（iii）在与ATP酶相互作用后，底物可直接通过IMC亚基形成的通道转移。
参考文献：
[1] Álvarez-Rodríguez I, Arana L, Ugarte-Uribe B, et al. Type IV Coupling Proteins as Potential Targets to Control the Dissemination of Antibiotic Resistance. Front Mol Biosci. 2020;7:201. Published 2020 Aug 12. doi:10.3389/fmolb.2020.00201
[2] Costa, TRD, Harb, L, Khara, P, Zeng, L, Hu, B, Christie, PJ. Type IV secretion systems: Advances in structure, function, andactivation. Mol Microbiol. 2021; 00: 1– 17. https://doi.org/10.1111/mmi. 14670
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