bam文件的理解

  做生信分析的小伙伴们，相信大家对bam文件都不陌生，但具体到如何get到bam文件提供给我们的信息，却少有人真正的理解，最近我做了相关的学习，和大家分享以下我的理解，具体的可参考黄树嘉的知乎分享https://zhuanlan.zhihu.com/p/31405418?from_voters_page=true

bam的来源

  二代测序获得的是bcl格式的原始下机数据，通过bcl2fastq软件https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/bcl2fastq-conversion-software.html可将bcl文件转换成每个样本的fq格式文件，也就是我们常理解的数据拆分。bam文件是由比对软件将质控后的fq格式文件与参考基因组进行比对后的比对信息存储文件。

bam的内容

  接下来我们理解下bam文件的内容。参考原文提出的一张经典图片：

header

上图格式的查看方法为：

samtools view -h *.bam|le

  samtools的header信息每一行都用‘@’ 符号开头，一般大家不会太关注，但其中的信息对于我们有些生信分析还是很重要的。这里需要重点提一下的是header中的@RG也就是Read group信息，这是在做后续数据分析时专门用于区分不同样本的重要信息。比如测序多条lane获得的bam的合并：如果原来样本的测序深度比较深，一般会按照不同的lane分开比对，最后再合并在一起，那么这个时候你会在这个BAM文件中看到有多个RG，里面记录了不同的lane，甚至测序文库的信息，唯一不变的一定是SM的sample信息，这样合并后才能正确处理。这个合并当然也可以在数据拆分后对rawdata进行cat合并，然后再生成bam文件。
  接下来是bam的主体内容record（有时候也叫alignment section，即，比对信息），每  一行代表一条reads，每条reads的信息用tab键进行分隔：

bam的record介绍

对于每列的解释如下表所示：

每列的解释

  接下来我们重点看看每一列在我们的分析中起到的作用。
   - reads name: 每一条reads的查询名称，来源于fastq文件；
   - flag：flag是比对质量的重要信息，不同的值代表比对结果的类型。Flag是比对结果质量的一个直观表述。该值是一个10进制的结果，根据表格可转换成二进制对应的质量描述，用来对数据进行过滤。比如说过滤掉未比对到参考基因组的reads（Flag=4），过滤掉二次比对的reads(Flag=256)，过滤掉嵌合reads（Flag=2048），使用samtools过滤的方法为：

samtools view -h -q 20 -F 4 -F 256 -F 2048 -Sb  sample.bam >  sample.filter.bam

  比如十进制数据77 = 000001001101 = 1 + 4 + 8 +64，这样就得到了这个FLAG包含的意思：PE read，read比对不上参考序列，它的配对read也同样比不上参考序列，它是read1。
二进制的质量描述见下表：

二进制质量值对照表

   - MAPQ：比对质量值，这个是大家最为熟悉的比对质量值了。比如说Q30（错配率为0.001），Q20（错配率为0.01），计算公式为：-10logP{错比概率} 。一般结果是这一列的数值是从0到60，且0和60这两个数字出现次数最多。
   - CIGAR：该标签采用数字和几个字符的组合形象记录了read比对到参考序列上的细节情况，读起来要比FLAG直观友好许多，只是记录的是不同的信息。比如，一条150bp长的read比对到基因组之后，假如看到它的CIGAR字符串为：33S117M，其意思是说在比对的时候这条read开头的33bp在被跳过了（S），紧接其后的117bp则比对上了参考序列（M）。这里的S代表软跳过（Soft clip），M代表匹配（Match）。N表示可变剪接位置，常见于RNA-seq。H只出现在一条read的前端或末端，但不会出现在中间，S一般会和H成对出现，当有H出现时，一定会有一个与之对应的S出现。CIGAR的标记字符有“MIDNSHP=XB”这10个，分别代表read比对时的不同情况：

CIGAR的标记字符